斑马鱼在毒理学中的研究进展

金梦凡　王晨阳　吕美君　雷小玲　尹争志

【摘 要】斑马鱼作为一类脊椎模式动物，具备体型小、传代周期短、繁殖率高、体外受精发育、胚胎透明、饲养管理方便等优势，在毒理学研究领域发挥着越来越重要的作用。目前，斑马鱼已被广泛用于环境毒理学、病理毒理学、胚胎发育毒理学等方面的研究，初步展现出其独特的优势，本文综述了斑马鱼在毒理学研究中的进展。

【关键词】斑马鱼；毒理学；进展

【Abstract】Zebrafish belongs to a kind of model vertebrate animals， and zebrafish plays more and more important role in the field of toxicology research due to the advantages including small size， short period of subculture， high reproduction， in vitro fertilization and development， transparent embryos， convenient feeding and management， etc. Zebrafish has been widely used in the field of environmental toxicology， pathology toxicology， embryonic development toxicology and other fields， and shows its unique advantages. In this paper， the development of zebrafish in toxicology is reviewed.

【Key words】Zebrafish； Toxicity assessment； Progress

0 引言

斑马鱼属热带淡水鱼，全身布满多条深蓝色纵纹似斑马，成群游动时犹如奔驰的斑马群，故称作斑马鱼。斑马鱼常年产卵，成熟雌鱼两周可产卵几百枚，卵在体外受精、发育，胚胎发育同步、速度快，3到4个月即可达到性成熟，成鱼体长3至4厘米、体型纤细。斑马鱼对生存水质要求不高，适宜水温为25～31℃。目前，斑马鱼遗传图谱已经建立，分析了有价值的突变体，发展了转基因斑马鱼技术，其中透明斑马鱼得到了大力推广，这些都提供了良好的毒理学研究平台。斑马鱼己被广泛应用于遗传和发育、环境、病理等毒理学研究领域，展现出其独特的优势。

1 斑马鱼评价生殖和发育毒理效应

1.1 斑马鱼评价胚胎发育毒性

斑马鱼胚胎透明和体外发育，便于在正常生长发育及外源物质的处理下，观察发育进程变化。在胚胎发育的致畸或致死原因中，血管、心脏和神经发育是最主要的三个方面，一直处于研究热点，然而斑马鱼胚胎在这三个方面的研究应用尚属起步阶段。同时，斑马鱼具有学习、记忆、群聚、昼夜节律等复杂行为，国内外学者已用该模型进行神经发育毒理学研究，以探讨神经系统疾病的发病机制与治疗方法[1]。

1.2 斑马鱼在神经毒性方面的应用

斑马鱼具有敏感的脑神经系统，生命早期即可呈现典型的运动模式，如自主性收缩、碰触反应、泳动等。自发性运动可以作为多巴胺神经元潜在毒性的指标，用于检测脑神经系统和评价脑的早期发育。在神经毒性研究领域，斑马鱼与哺乳动物模型一样，可以借助生化指标、形态学、行为学来评价药物的神经毒性，检测斑马鱼脑部神经元的坏死和凋亡情况；未来，斑马鱼在神经学方面，将具有更加重要的研究价值[2-4]（图1）。

1.3 心脏发育及心血管方面的应用

斑马鱼的胎心类似于人类胚胎的心脏，分为心房和心室，房室之间有瓣膜，因而为研究人类心血管系统提供了一类较好的模型。而且，斑马鱼的卵体透明、胚胎发育快、心脏体节清晰，早期发育存活不依赖于血液循环，可用肉眼直接观察活鱼卵心脏的明显形态和功能缺陷，或通过分子标记物来识别细微差别。受精48 小时后，发育正常的的斑马鱼胚胎，即可用于心脏毒性研究。斑马鱼在心血管药物氯氮平、红霉素、奎尼丁、阿司咪唑等评价方面都有所研究。Zhang等对斑马鱼心脏复苏进行了研究报道[5]。一些药物可导致斑马鱼心包水肿、心脏畸形、心率减低，体长缩短、体节发育异常、脊柱弯曲、卵黄囊水肿、出血、心脏缩小等多种表型改变。

1.4 斑马鱼评价骨骼发育毒性效应

硬骨鱼发育中的基因、信号通路和人类骨骼发育具有高度同源性，相对于其他模型动物，斑马鱼具备个体小、繁殖快、适合高通量筛选、身体透明、易于观察骨骼发育等优势。近年来，以斑马鱼为模型的骨骼研究逐渐成为热点，其中，中药治疗骨质疏松的功效正日益受到重视，但壮骨中药及其成分，特别是量微成分的活性评价却难以有效开展。新模型、新方法的建立有益于丰富中药壮骨效应评价的思路与方法。模式生物斑马鱼既是一类较好的、热门的药学研究工具，根据其骨骼发育的生理、遗传学特点和优势，将斑马鱼用于中药复杂体系及成分的壮骨效应评价，具有合理性和可行性。

2 病理毒理学中的应用

2.1 斑马鱼评价感官毒理学效应

斑马鱼的卵受精 72 小时后，视网膜已与成鱼相似，而且幼鱼眼睛占身体的很大部分，操作极其方便，斑马鱼特别适用于眼部疾病的研究。一旦其视力受损，斑马鱼会经常生活在暗处，皮肤的色素沉积黑素体随之增加，通过眼睛大小或皮肤上的色素沉积可以方便快速地筛选出有视觉缺陷的斑马鱼。目前，发现的斑马鱼眼部特异性细胞或层损伤突变体已超过 50 种，视功能和眼球运动的有关试验还在进行中[6]。

在斑马鱼模型中，耳的生长发育和功能、味蕾的细胞分子机制研究相对较少，但也都在展开进一步的研究。斑马鱼的听觉器官由耳囊及附属结构（如毛细胞和半规管）组成。斑马鱼神经丘毛细胞损伤可作为检测耳毒性的一个重要指标，辅以斑马鱼幼体的游泳姿态和体位指标，可以对药物的耳毒性进行快速、简便的毒性筛选。

2.2 免疫系统方面研究

斑马鱼的免疫系统与高等脊椎动物相比，既有共性又有特殊性，近年来，斑马鱼在免疫学领域的应用研究逐渐被人们所重视[7-8]。哺乳动物中，骨髓和胸腺属于中枢免疫器官，外周免疫器官有脾和淋巴结；而斑马鱼的肾是生成免疫细胞的主要器官，类似于人类的骨髓，在其中发现有T细胞、B细胞及树突状细胞。采用基因芯片技术筛选与鱼类皮肤免疫相关的功能基因，将有助于鱼类皮肤局部免疫应答的分子机制研究（图2）。

2.3 内分泌系统研究

内分泌干扰物广泛存在于水环境中，能够使脊椎动物的发育、生理自身调节和健康状况发生改变，引起了环境科学领域的广泛关注。目前常采用VTG诱导这一内分泌干扰研究方式，广泛筛选潜在影响内分泌通路的污染物，则需要转录组方法、组织病理学方法。性激素、生长激素、损伤修复酶系等在斑马鱼生长发育过程中起重要调控作用；内分泌扰乱物质对其生长发育影响的研究，主要集中于其对性激素的影响。目前，在激素水平研究内分泌生理和毒理存在一定难度，主要因为难以采集足量的测定血液，整体的激素检测技术还不成熟。

3 斑马鱼的生态毒理学研究

3.1 在常规毒性试验中的应用

我国制定了关于水质的毒性实验方法，用于衡量水中单一化学物质或工业废水的毒性。采用半静态法测定了 360 种常用农药制剂对斑马鱼的毒性效应，结果表明：近一半的制剂对斑马鱼表现高毒或剧毒效应，涉及 25 种农药的有效成分，主要为杀虫剂，毒性相远高于杀菌剂和除草剂，微生物农药对斑马鱼的毒效应较低，而部分植物源农药表现的毒性较高；相同有效成分的不同制剂之间由于有效成分含量、剂型及加工工艺的不同，会表现不同的毒效应。

3.2 在生物诱导效应评价中的应用

斑马鱼胚胎常被用于生物诱导方面的研究。诱导产生的效应有脊椎形态异常、体节减少、心脏血液系统异常、鳃弓及腭发育异常、 脑和神经系统退化、鱼鳍发育不全和鱼鳔缺失等现象，其中以脊柱和体节异常为主。也可以利用斑马鱼对生物诱导剂的敏感作用，检测水环境中的生物诱导剂。用腺苷二磷酸诱导斑马鱼血小板，发现腺苷二磷酸能使斑马仔鱼血小板在其眼睛、背部等处聚集，一定条件时可导致其死亡（图3）。

3.3 斑马鱼评价纳米粒子毒性

纳米科技是 21 世纪的重点发展领域之一，目前，纳米粒子的生物安全性体外实验已取得了一些研究成果，但其体内安全性评价，由于各种限制而进展缓慢。斑马鱼是纳米粒子活体生物安全性评价的最佳模式动物。Patrick Lie Johansen等借助光学系统和透明斑马鱼/胚胎研究了活体中纳米粒子/细菌和细胞间的相互作用，构建了新型的研究平台和手段，为未来肿瘤诊疗、肿瘤组织损坏和生物感染研究，奠定了坚实的基础[10]。

4 结论与展望

斑马鱼作为脊椎动物，与人类基因的相似度高达87%，具有哺乳动物相似的心血管、造血、神经、代谢等系统，在遗传、生理和药理反应方面也与人类存在高度的相似性，基因和化学筛选证明，斑马鱼可以高度模拟人类和其他生物体。

斑马鱼在活体研究领域将起到越来越重要的作用，包括药物筛选和药效评价、水环境毒理学、食品科学、疾病甄治、脑神经科学、器官再生、细胞迁移、免疫学、细胞生物学、遗传学、发育学、分子生物学、社会学、行为学等方面。我们相信，我国斑马鱼领域将得到快速发展，应用领域将更加广泛，重大成果将更多涌现，为世界生命科学发展做出重要贡献。

【参考文献】

[1]Yuma O.； Thomas N.S. Whole-mount single molecule FISH method for zebrafish embryo[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8571|DOI： 10.1038/srep08571.

[2]Chen S.J.； Chiu C.N.； McArthur K.L.； et al. TRP channel mediated neuronal activation and ablation in freely behaving zebrafish[J]. Nature Methods， 2016， 13（2）： 147-152.

[3]Randlett O.； Wee C.L.； Naumann E.A.； et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas[J]. Nature Methods， 2015， 12（11）： 1039-1050.

[4]Andersson M.A.； Fredrik E.； Roger O. Using visual lateralization to model learning and memory in zebrafish larvae[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8667|DOI： 10.1038/srep08667.

[5]Zhang R.l.； Han P.D.； Yang H.B.； et al. In vivo cardiac reprogramming contributes to zebrafish heart regeneration[J]. Nature Letter， 2013， 498： 497-502.

[6]Affaticati P.； Yamamoto K.； Rizzi B.； et al. Identification of the optic recess region as a morphogenetic entity in the zebrafish forebrain[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8738|DOI： 10.1038 /srep08738.

[7]Tang Q.； Moore J.C.； Ignatiu M.S.； et al. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immunedeficient zebrafish[J]. Nature Communications， 2016， 7：10358|DOI： 10.1038/ncomms10358.

[8]Kaufman C.K.； Mosimann C.； Fan Z.P.； et al. A zebrafish melanoma model reveals emergence of neural crest identity during melanoma initiation[J]. Science， 2016， 351（6272）， （aad2197） 1-10.

[9]Jank T.； Eckerle S.； Steinemann M.； et al. Tyrosine glycosylation of Rho by Yersinia toxin impairs blastomere cell behaviour in zebrafish embryos[J]. Nature Communications， 2015， 6：7807|DOI： 10.1038/ncomms8807.

[10]Patrick L.J.； Federico F.； Lasse E.； et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish[J]. Nature Communications， 2016， 7：10974|DOI： 10.1038/ncomms10974.

[责任编辑：杨玉洁]