经久不愈奶牛临床型乳房炎病例的病原菌分离鉴定

杨　俊，吴　琼，王九峰，刘光男（.中国农业大学动物医学院，北京海淀0093；.内蒙古乌兰察布市动物卫生监督所，内蒙古乌兰察布0000）



经久不愈奶牛临床型乳房炎病例的病原菌分离鉴定

杨俊1，吴琼1，王九峰1，刘光男2
（1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；2.内蒙古乌兰察布市动物卫生监督所，内蒙古乌兰察布012000）

摘要：为了研究全身及局部应用抗生素治疗临床型乳房炎后病原菌的构成及比例，本试验对全身及局部灌注治疗后仍未痊愈的奶牛进行基本信息汇总并对乳样中病原菌进行形态学分离鉴定及16S rDNA基因序列分析。结果表明，经过治疗仍可分离到大量大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及绿脓假单胞菌等易产生耐药性的细菌。本试验为临床上经久不愈的乳房炎病例的治疗提供了参考方法。

关键词：奶牛乳房炎；病原菌；分离鉴定；16S rDNA

本研究对2015年4月北京市某奶牛场的患临床型乳房炎的奶牛经过全身应用抗生素后经久不愈病例奶样的病原菌的分离与鉴定，了解治疗效果不佳病牛的病原菌分离情况，为寻找更好的治疗经久不愈乳房炎病例及控制奶牛乳房炎的发展提供依据。

1　试验试剂与设备

1.1主要试剂血平板、7.5%甘露醇氯化钠琼脂、伊红美兰（EMB）琼脂、S.S.琼脂及葡萄球菌生化鉴定管，购自北京奥博星生物技术责任有限公司，厌氧袋，购自日本三菱化学株式会社；PCR体系，购自北京博迈德基因技术有限公司。

1.2主要仪器与设备TCYQ型恒温振荡培养箱，购自太仓市实验设备厂；SW-CJ-1FD型单人单面垂直净化工作台，购自苏州智净净化设备有限公司；DHP-9052型电热恒温培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；Model#：99 02型PCR仪，购自美国ABI公司；DYY-6C型电泳仪，购自北京市六一仪器厂；凝胶成像仪，购自美国Alpha Innotech公司；立式高压蒸汽灭菌器YXQ-LS-50SⅡ，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

2　材料与方法

2.1试验材料采自北京市某奶牛场9头患临床型乳房炎并经过全身及局部用药仍未痊愈的荷斯坦泌乳牛9个乳区乳样，并取3个健康乳区乳样进行对照试验。首先乳区消毒后，弃去前3把奶，每个乳区采30～40 mL盛于经过高压灭菌的离心管中并作好标记，置于冰盒，尽快送往实验室并进行后续试验。

2.2试验方法（1）将乳样涂于血平板：先取乳样划线接种于血平板上，另用厌氧袋做一份厌氧培养，37℃培养箱培养48 h；（2）将乳样同时接种于选择性培养基：7.5%甘露醇氯化钠琼脂、EMB、S.S.琼脂选择性培养基，24 h后观察在各个培养基上的结果，统计常见细菌在各乳区的分布情况；（3）取（1）中特异性菌落，及选择性培养基中非特异菌落溶解于生理盐水中进行16S rDNA通用引物PCR后，测序，根据测序结果对细菌进行生化试验。上游引物序列[1]：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′，下游引物序列：5′-TAC GGY⁃TAC CTT GTT ACG ACT T-3′，目的条带1 465 bp。

3　结果

3.1取样奶牛及乳区信息由表1可知，在患病的9个乳区中处于围产期的有2个（22%），泌乳早期的有3个（33%），中期的有3个（33%），后期有1个（11%），9头患病牛中只有2个体温高于正常，泌乳量除编号5外均明显降低。

表1　取样奶牛及乳区基本信息

3.2细菌分离结果由表2可知，综合7.5%甘露醇氯化钠琼脂、EMB、S.S.琼脂选择性培养基结果、单菌落16S PCR、葡萄球菌属细菌生化试验结果，从12份乳样中共分离出16种，27株细菌。其中葡萄球菌属细菌最多，共有16株，共覆盖9个乳区（75%），其中占发病的9个乳区中7个（78%），健康的3个乳区占2个（67%），其中又以表皮葡萄球菌最多，覆盖了8个乳区，占了所有乳区的67%，乳房炎最常见的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌覆盖率分别为58%、33%。

表2　分离鉴定出的细菌种类及分离率

4　讨论

虽然此次分离出多种细菌，但是由于目前很多细菌仍不能培养仍有可能漏检部分致病菌，原因如下：细菌相互干扰；优势菌对劣势菌的抑制作用；一般根据固体培养基上细菌的大小、颜色以及形态判断，因此若某些细菌有相似的形态特征容易漏检；浓度低也是培养阴性的重要原因；还有可能是此病原体为目前条件下不可培养或此种细菌在该培养基下不能生长或该培养基缺少此种细菌生长所需物质，可以用多重PCR或高通量测序鉴别，以获得更全面的信息[2]。乳房炎发病率与管理和养殖环境的好坏密切相关，但在一定的管理和养殖条件下乳房炎发病率又与年龄、胎次、泌乳期高度相关，由于此次样本量较少，经久不愈乳房炎与年龄、泌乳期、胎次的关系并不具有统计学意义需在以后的试验中考虑到这一点。据报道有2%～55%乳牛在泌乳阶段发生乳房炎[3]。抗生素疗法在泌乳期间对许多导致乳房炎的病原体治愈率比较低，特别是对于金黄色葡萄球菌，经常导致慢性和复发性感染[4]，本次试验所用样品均为抗生素长期诱导所致，全身疗法（氨苄西林、四环素、头孢噻呋等静脉注射）配合林可霉素乳房灌注，但是治疗效果不佳，因此有必要将本次试验所得菌株进行后续试验以为开辟用于治疗导致久治不愈乳房炎细菌的新途径。国内外很多研究者已经将目光投向了抗生素的替代品，已知乳酸杆菌对一些感染有保护作用。这种能力与上皮细胞的粘附性能有关，通过特定的竞争或位阻抑制病原体粘附，以及分泌细菌素、H2O2、或其他抗菌复合物，竞争营养物质和

调节宿主免疫应答来抑制病原体的生长[5]，因此乳酸杆菌在乳房炎的治疗上有望替代抗生素。据（Damien S. Bouchard等）报道，他们通过探究乳酸杆菌菌液中到底是细菌、培养液、乳酸、pH值、蛋白是哪种成分对金黄色葡萄球菌粘附及侵袭造成的影响，得出只有与活的乳酸杆菌接触才能抑制金黄色葡萄球菌的侵袭，加热灭活的乳酸杆菌只能抑制金黄色葡萄球菌的粘附的结论[9]。细菌入侵乳腺上皮细胞是细菌导致乳房炎的重要机制，因此有人试图通过抑制细菌的内化作用来治疗及预防乳房炎，其中研究抑制金黄色葡萄球菌的内化比较多，目前已经发现丁酸钠、杜鹃素、麝香草酚、短链脂肪酸（丙酸和丁酸），乳酸杆菌还有VD3都能抑制金黄色葡萄球菌内化入乳腺上皮细胞及调节抗菌肽基因的表达[6-7]。

大肠杆菌、克雷伯氏菌、乳房链球菌是导致乳房炎最常见细菌，其次是化脓隐秘杆菌、停乳链球菌，再次为金黄色葡萄球菌[8]，在健康或亚临床乳样中，厌氧菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌所占比例明显低于临床型乳房炎[9]。此次细菌分离结果表明，经过上述治疗像链球菌、克雷伯氏菌等乳房炎常见的病原菌均未分离到，余下的是葡萄球菌属、大肠杆菌、绿脓假单胞菌等易产生耐药性的细菌，这可能是抗生素选择的结果，可以进行药物敏感试验后进行联合用药治疗。据Georgios Oikonomou[9]等报道，健康乳汁与乳房炎乳汁中细菌种类均很多，其研究结果表明，健康乳样中不含有大肠杆菌与克雷伯氏菌，这与本次试验结果相悖，在10号乳区中分离到了大肠杆菌，这可能是由于仅凭临床症状判断乳房炎的有无，没有采用SCC、CMT等方法检测是否患有隐性乳房炎，因此以后的检测需辅助SCC等指标。

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Isolation and identification of main pathogenic bacteria causing prolonged unhealed bovineclinical mastitis

YANG Jun1，WU Qiong1，WANG Jiu-feng1，LIU Guang-nan2
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Inner Mongolia Wulanchabu City Animal Health Inspection，Wulanchabu 012000，China）

Abstract：The aim of the present study is to detect the composition and proportion of pathogenic bacteria in milk samples from prolonged unhealed clinical mastitis cows after systemic and local application of antibiotics .We collected the basic informa⁃tion of the prolonged unhealed cows，and identified the pathogens through the colony morphology and 16S rDNA gene sequencing. The results showed that pathogenic bacteria（Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Bacillus pyocyaneus）were resistant to an⁃tibiotics.This study provides an approach to treat prolonged unhealed clinical mastitis.

Key words：Bovine mastitis；Pathogenic bacteria；Identification；16S rDNA

中图分类号：S858.23

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0087-02

收稿日期：2016-01-29

基金项目：奶牛产业技术体系北京市创新团队项目（BAIC0-62016）

作者简介：杨俊（1990-），男，硕士生，从事临床兽医研究，E-mail：yang_jun1992@126.com

通讯作者：刘光男，E-mail：wsy4886061@163.com

Corresponding author：LIU Guang-nan