中国汉族人群前交叉韧带损伤与β-fib基因多态性的相关性

陈鸿 史荔 张俊 赵道洪 史磊陆秦楠 张启 段祺辉 舒嵩华

1昆明市第一人民医院运动医学关节外科（昆明650000）

2中国医学科学院医学生物学研究所

3昆明医科大学第二附属医院骨科

中国汉族人群前交叉韧带损伤与β-fib基因多态性的相关性

陈鸿1史荔2张俊3赵道洪3史磊2陆秦楠1张启1段祺辉1舒嵩华1

1昆明市第一人民医院运动医学关节外科（昆明650000）

2中国医学科学院医学生物学研究所

3昆明医科大学第二附属医院骨科

目的：探索β-fib基因多态性与中国汉族人群前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤发生的关系。方法：收集105名ACL损伤的汉族患者，以110名无ACL损伤史的汉族个体作为对照，通过限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析、测序技术对β-fib基因启动子区单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）进行检测并分型，开展病例对照关联分析。结果：β-fib基因启动子区共检出6个SNPs，包括;β-148C/T（rs1800787）、β-249C/T（rs1800788）、β-455G/ A（rs1800790）、β-854G/A（rs1800791）、β-933G/A（rs2227389）、β-1420G/A（rs1800789），其中rs1800790、rs1800788和rs1800787的AG、CT和CT基因表型频率在病例组中高于对照组 （P＜0.05）。rs2227389-rs1800791-rs1800790单倍型C G A*、T G A*、T G G*在病例组和对照组中也显示统计学差异。结论：在中国汉族人群，β-fib基因启动子区rs1800790、rs1800788和rs1800787及其单倍型可能与ACL损伤的发生相关。

前交叉韧带损伤；β-fib基因多态性；病例对照研究

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是人体膝关节中重要的静力性稳定结构，ACL损伤在膝关节的损伤中较为常见，是引起膝关节功能障碍的常见因素之一[1]。 ACL损伤常使患者健康水平下降，将出现胫骨前移并导致膝关节不稳，继而出现半月板损伤，尤其内侧半月板损伤多见[2]，且ACL损伤时间越久，关节软骨退变的范围和程度越大[3]，结果会进一步加速膝关节的退行性改变和骨关节炎的发生[4]。大量研究表明ACL损伤的患者关节炎发生的概率远高于无损伤的患者[5，6]。明确ACL损伤的原因将有助于预防膝关节损伤，但目前ACL损伤发生的病因尚不清楚，Bahr等[7]认为内部因素和外部因素共同作用导致ACL损伤，而作为内部危险因素之一的遗传因素逐渐受到人们的重视[8]。研究表明，在ACL损伤的发生过程中以及手术后，常常伴随着纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）水平的显著升高[9-11]。而β-fib基因决定纤维蛋白β多肽链的合成进而影响血浆纤维蛋白原水平的大部分变化。由于不同人种或不同地区的人群存在基因异质性，在中国人群中β-fib基因多态性是否与ACL损伤相关呢？本研究探讨β-fib基因启动子区的基因多态性与中国汉族人群ACL损伤发生的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象

纳入标准：（1）体格检查膝关节不稳、磁共振（MRI）与关节镜检查明确ACL损伤；（2）除ACL损伤，不合并有膝关节其他部位的韧带损伤。

排除标准：（1）除ACL损伤，合并有膝关节其他部位的韧带损伤；（2）既往风湿或类风湿性关节炎、化脓性关节炎、膝关节结核等膝关节疾病患者；（3）既往膝关节手术或外伤患者。

2011年10 月至2015年10月，研究包括105名ACL损伤患者和110名正常对照者：ACL损伤患者男73例、女32例，平均年龄33.62±11.18岁，左ACL损伤41例，右ACL损伤64例；正常对照者男69例、女41例，平均年龄35.57±12.78岁。均为汉族。临床诊断前交叉韧带损伤的方法主要包括：临床膝关节稳定性体格检查提示膝关节不稳，膝关节MRI检查提示ACL异常信号，关节镜检查明确ACL损伤。本次试验的ACL损伤病例同时满足以上三方面的检查标准，上述三个标准均不满足者进入对照组。本研究获得昆明医科大学第二附属医院及昆明医科大学临床研究伦理委员会批准通过，经患者和正常对照本人及其家属同意并签署同意书。

1.2DNA提取、定量

采集ACL损伤病例及对照组外周静脉血5 ml， EDTA抗凝。使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒提取样本的基因组DNA，采用琼脂糖凝胶电泳对样品DNA进行测定。电泳条件：4V/cm，2%琼脂糖电泳45分钟，凝胶成像。使用分光光度计ND-1000测定DNA浓度，调节DNA浓度至15 ng/μL～20 ng/μL。

1.3fib启动子SNP检测

1.3.1PCR引物设计

用DNASTAR primerselect设计引物序列。引物设计完成后在UCSC上进行PCR确认扩增序列准确性和长度。再将序列输入NCBI进行BLAST序列比对，再次确认序列准确性和长度；同时确认扩增序列中的限制性核酸内切酶酶切位点是否是待检测的SNP位点和酶切片段的长度。最后抽取一些样本进行测序确认。引物序列 （扩增片段 1560bp）为：上游引物 （F）：5’-ACGTCACTAAAATAAAATCCTGTCTA-3’；下游引物（R）：5’-GAAGCTCCAAGAAACCATCC-3’

1.3.2PCR扩增：PCR反应体系

10×PCR扩增缓冲液2.0 μL、dNTP1.6 μL、正向引物0.2 μL、反向引物0.2 μL HostStart rTaq聚合酶0.1 μL、模板DNA 1.3 μL，再加入双蒸水至20 μL。PCR反应程序 94℃，3 min（94℃，30 s；58.9℃，30 s；72℃，2 min）×30；72℃，10 min，4℃保存。

1.3.3双向测序

扩增PCR产物经生工生物工程（上海）有限公司测序，检测β-fib基因启动子区多态位点。

1.4统计学分析

所有数据采用 SPSS17.0进行统计分析。采用Hardy-weinberg遗传平衡定律检验病例组和对照组的基因频率以及等位基因频率。运用SHEsis程序[12]（http：//analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php）分析统计β-fib基因启动子区的基因型、等位基因及其单倍型频率。位点的多态性与ACL损伤风险之间的相关性用比值比（oddsratio，OR 值 ） 及 其 95% 可 信 区 间（confidenceintervals，CI）表示。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1β-fib基因启动子区SNP检测

β-fib基因启动子区共检出6个SNPs，包括；β-148C/T（rs1800787），β-249C/T（rs1800788），β-455G/A （rs1800790），β-854G/A（rs1800791），β-933G/A（rs222-7389），β-1420G/A（rs1800789）。测序结果如图1。

2.2β-fib基因病例对照分析

2.2.1Hardy-Weinberg平衡检验

对照组与感染组等位基因的频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P值均＞0.05），说明人群具有代表性。

图1 β-fib基因启动子区6个SNPs测序结果

2.2.26个SNPs在病例组与对照组中等位基因频率与基因型频率比较

研究比较了6个SNPs在病例组和对照组中等位基因频率，以及基因型频率分布。结果6个SNPs等位基因频率在病例组和对照组中未显示差异 （P值均＞0.05），但 rs1800790、rs1800788和 rs1800787的AG、CT和CT基因表型频率在病例组中高于对照组，其差异具有显著性意义，P值分别为0.0045、0.0022和0.010。这提示rs1800790、rs1800788和rs1800787可能与ACL的发生相关。结果见图2和3。

图2 β-fib基因6个SNPs等位基因频率比较

图3 β-fib基因6个SNPs基因型频率比较

图4 β-fib基因6个SNPs连锁不平衡图

2.2.36个SNPs连锁不平衡分析

将β-fib基因6个SNPs进行连锁不平衡分析，结果如图4显示 ：rs2227389、rs1800791和rs1800790连锁不平衡较高。其余位点之间连锁程度较低。

2.2.4单倍型构建及病例对照分析

根据连锁不平衡分析结果，构建了rs2227389-rs1800791-rs1800790单倍型，并进行对照病例分析，结果发现C G A*，T G A*，T G G*单倍型显示差异有统计学意义。见表1。

表1 rs2227389-rs1800791-rs1800790单倍型ACL病例—对照分析结果

3 讨论

目前，ACL损伤的发病机制并不十分清楚，内外多种因素都可能与ACL损伤的发生相关。长期以来，学者们关注于ACL的三维空间结构、三维力学机制的分析研究。但近年来，多种高风险因子的发现表明基因与基因、基因与环境的相互作用在ACL损伤发生中也起到非常重要的作用。研究表明：性别、家族因素、特殊的遗传序列变异等也是ACL损伤发生的高风险因素。ACL损伤在女性的发生率高于男性，Posthumus对Ⅴ型胶原基因COL5A1基因多态性进行了分析，结果发现：女性ACL损伤患者COL5A1 BstUI RFLP CC基因型的频率显著高于对照[13]。另外，女性XII型胶原基因COL12A1 AluI RFLP AA型ACL损伤的风险也增高[14]。Khoschnau等观察到Ⅰ型胶原基因COL1A1 Sp1结合位点的多态性与ACL损伤减低相关[15]。而且ACL损伤患者亲属中ACL损伤的发生率高于正常，是正常的2倍，患者一级亲属的ACL损伤的发生率则达到2倍以上[16]。这些数据都提示遗传因素在ACL损伤的发生中起到一定作用。对遗传高风险因子的鉴别有利于确定在职业或非职业体育活动中，重复性的机械负荷是否是导致个体损伤增加的因素，而且有助于在未来的治疗中，针对不同个体采用最有效的治疗方法。同时，遗传风险因素也是决定损伤预后的重要因素。因此，ACL损伤的遗传机制分析越来越受到重视，研究表明除了胶原蛋白（COL1A1，COL5A1，COL12A1）基因，还有基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体-2（KDR）、肌原纤蛋白2（FBN2）等基因编码或表达ACL的结构，并与ACL损伤有关[17-19]。

纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）是肝脏合成的一种血浆球蛋白，由完全相同的两个亚基组成，每个亚基含有α、β、γ三条肽链，主要作为凝血因子Ⅰ 参与凝血，是凝血系统的核心蛋白质，它在凝血过程的最后阶段被凝血酶切断纤维蛋白原α链N-末端区域的纤维蛋白肽A和β链N-末端区域的纤维蛋白肽B而生成纤维蛋白单体，最终形成不溶性纤维蛋白凝块而发挥血液凝固作用。纤维蛋白原3对多肽链分别由3条独立的基因（α、β、γ）编码，其中纤维蛋白原Bβ链的mRNA合成被认为是控制整个分子合成的限速步骤，所以β-fib基因决定了纤维蛋白β多肽链的合成进而影响血浆纤维蛋白原水平的大部分变化。本实验对β-fib基因启动子区的基因多态性进行初步研究，共检出6个SNPs：β-148C/T（rs1800787），β-249C/T（rs1800788），β-455G/ A （rs1800790），β-854G/A （rs1800791），β-933G/A （rs2227389），β-1420G/A（rs1800789）。病例对照分析结果表明：rs1800790，rs1800788和rs1800787的AG、CT 和CT基因表型频率在病例组中高于对照组，其差异具有显著性意义，P值分别为0.0045、0.0022和0.010。进一步构建的rs2227389-rs1800791-rs1800790单倍型C G A*、T G A*、T G G*在病例组和对照组中也显示统计学差异。近年来的研究也表明，在ACL损伤的发生过程中以及手术后，常常伴随着纤维蛋白原水平的显著升高[9-11]。

4 结论

综上所述，在中国汉族人群，β-fib基因启动子区rs1800790、rs1800788和rs1800787及其单倍型可能与ACL损伤的发生相关。

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Association of β-fib gene polymorphisms with ACL injury in Chinese Han Population

Chen Hong1，Shi Li2，Zhang Jun3，Zhao Daohong3，Shi Lei2，Lu Qinnan1，Zhang Qi1，Shu Songhua1
1 Sports Medicine and Joint Surgery，The First People’s Hospital of Kunming，Yunnan 650000，China
2 Institute of Medical Biology，Chinese Medical Sciences Academy，Yunnan 650000，China
3 Department of Orthopedics，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Yunnan 650000，China

Lu Qinnan，Email：luqinnanyn@163.com

ObjectiveTo investigate the association of polymorphisms of β-fib gene with anterior cruciate ligament（ACL）injury in Chinese Han population.MethodOne hundred and five ACL injury patients were recruited in an experimental group，while 110 healthy counterparts were selected into a controll group.RFLP analysis and genetic sequencing technology were applied to detect and classify the single nucleotide polymorphisms（SNPs）in the β-fib gene promoter region.Then association analysis was conducted.Result In the β-fib gene promoter region，6 SNPs were detected as follow：β-148C/T （rs1800787），β-249C/T （rs1800788），β-455G/A （rs1800790），β-854G/A （rs1800791），β-933G/A （rs2227389），，β-1420G/A （rs1800789））.Moreover，the AG，CT and CT phenotypes of β-fib rs1800790，rs1800788 and rs1800787 gene were found significantly more in the experimental group than the control group （P＜0.05）.Significant differences were also found in the appearance of rs2227389-rs1800791-rs1800790 haplotype CGA*，TGA*，TGG* between the 2 groups.Conclusionβ-fib rs1800790，rs1800788 and rs1800787 genes and their haplotypes were related to ACL injury in Chinese Han population.

ACL injury，β-fib gene polymorphism，association analysis

2016.01.19

云南省科技计划项目（昆医联合专项）（40210029）

陆秦楠，Email：luqinnanyn@163.com