磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表达载体的构建及在细胞中的表达

程华方向东崔硕吴萌张昭军李泽夏

（1.河北省科学院生物研究所，石家庄 050081；2.中国科学院北京基因组研究所，北京 100101）

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表达载体的构建及在细胞中的表达

程华1方向东2崔硕1吴萌1张昭军2李泽夏2

（1.河北省科学院生物研究所，石家庄 050081；2.中国科学院北京基因组研究所，北京 100101）

构建载体表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）蛋白，用以获得抗GPC3单克隆抗体。用PCR技术扩增GPC3基因，利用酶切位点将该序列插入p3XFLAG-CMV-14载体，构建pCMV-gpc3表达载体。通过脂质体将该载体转染至HEK293细胞中，利用Western blot技术检测最终结果。收集稳定表达的细胞，破碎，通过亲和层析柱，获得纯度较高的GPC3蛋白。成功构建pCMV-gpc3真核表达载体，转染至HEK293细胞后，经G418筛选获得稳定表达的单克隆细胞系；Western blot分析结果表明目的蛋白高效表达。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；真核表达；脂质体转染；亲和纯化

磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一个家族，参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程［1-3］。有研究表明，Glypican-3与多种肿瘤的发生发展关系密切，特别是在肝细胞癌中特异性高表达，是一种潜在的肝癌血清学和组织学重要诊断标志物［4-12］。另外，近期的研究表明GPC3不但能够用于肝癌的诊断，而且具有抑制肝癌细胞系生长的功能［13］，该发现为肝癌的特异性治疗提供了新的思路。

本研究利用真核表达载体和脂质体转染技术，获得了稳定表达Glypican-3的单克隆细胞系。通过大量培养、细胞破碎和亲和纯化，获得了一定数量的GPC3蛋白，为进一步研究GPC3的分子生物学特性和功能奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、菌株与质粒 含GPC3基因的质粒由德国洪堡大学病理学研究所Lage博士惠赠；克隆菌株E.coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；克隆载体pMD18-T购自宝生物公司；人胚胎肾细胞HEK293购自国家实验细胞共享平台；表达载体p3XFLAG-CMV-14购自Sigma公司。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ、T4连接酶、Pfu DNA聚合酶均购自New England Biolabs公司；DNA分子质量标准和凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；蛋白质分子量标准购自美国热电公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Life公司；ANTI-FLAG® M1 Agarose Affinity Gel及ANTIFLAG抗体购自Sigma公司；兔抗人GPC3蛋白和兔抗人β-actin抗体购自美国ABcom公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG抗体购自北京华美公司；细胞培养板、DMEM培养基，胎牛血清，均购自美国GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根据GPC3的基因阅读框序列设计扩增引物，上游引物：5'-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3'（下划线部分为EcoR Ι酶切位点）；下游引物：5'-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3'（下划线部分为BamH Ι酶切位点）。使用上述引物，以含GPC3基因的质粒为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸15 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 重组质粒pMD18-gpc3的构建及鉴定 将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，连入pMD18-T载体，产物用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒pMD18-gpc3。

1.2.3 重组质粒pCMV-gpc3的构建及鉴定 将质粒pMD18-gpc3和质粒p3XFLAG-CMV-14分别用EcoR Ι和BamH Ι双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。取含有酶切位点的目的基因和经双酶切的p3XFLAG-CMV-14用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒pCMV-gpc3。

1.2.4 HEK293细胞的培养 HEK293细胞培养于37℃、5% CO2培养箱中，培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。待细胞密度达到90%时，用0.05%胰蛋白酶进行消化传代，传代比例为1∶3。

1.2.5 重组质粒转染 将状态良好的HEK293细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，继续培养，待细胞密度达到80%-90%时进行转染。用PBS冲洗3次，加入无血清DMEM高糖培养基。按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行，转染时设立阴性组（p3XFLAG-CMV-14）和阳性组（pCMV-gpc3质粒）。细胞转染48 h后用含有0.5 mg/L G418、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基加压筛选，采用有限稀释法原理将细胞转至96孔板，每孔1-2个细胞。待96孔板内细胞增殖成团后，传至细胞培养瓶继续培养，最终得到稳定表达重组蛋白的单克隆细胞株pCMV-gpc3/293和阴性对照组pCMV-gpc3/NC。

1.2.6 Western blot检测转染后GPC3蛋白表达水平 待稳定表达重组蛋白的细胞株和HEK293细胞生长至密度约90%时，收集细胞，裂解细胞提取细胞总蛋白，提取方法按照试剂盒说明书进行。BCA法测定蛋白浓度后，取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳，参照文献［14］的方法进行。

电泳结束后以恒压90 V，利用半干转移设备将蛋白转移至PVDF膜上；将转好的膜浸入封闭液（含5%（M/V）脱脂奶粉的TBST中，室温轻摇封闭2 h；以购买的兔抗人GPC3蛋白抗体、兔抗人β-actin和ANTI-FLAG抗体为一抗，用封闭液按1∶1 000稀释，室温轻摇孵育2 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，用封闭液按1∶10 000稀释，室温轻摇孵育1 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；ECL发光显色系统显色。

1.2.7 重组蛋白的分离纯化及验证 大量培养筛选到的单克隆细胞，参照文献［14］的方法对细胞进行破碎，低温离心取上清液按照ANTI-FLAG® M1 Agarose Affinity Gel试剂盒说明书进行纯化。采用超滤的方法浓缩重组蛋白，取适量蛋白进行SDSPAGE电泳，Western blot检测重组蛋白。

2 结果

2.1 GPC3基因的扩增

用PCR方法进行扩增。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，其中以无菌水为模板的阴性对照组没有出现扩增条带，而以含GPC3基因的质粒为模板，扩增到了一条长1 650 bp的片段，结果（图1）与预期大小相一致。

图1 GPC3基因PCR扩增结果

2.2 重组质粒的构建与鉴定

构建的重组质粒pMD18-gpc3和表达质粒pCMV-gpc3进行EcoR Ι和BamH Ι双酶切，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图2）与预期大小相一致。质粒pCMV-gpc3经测序鉴定，测序结果表明插入片段与GenBank中公布的全序列中该片段完全一致，且以正确的方向插入到表达载体的克隆位点，真核表达载体质粒pCMV-gpc3构建成功。

图2 重组质粒酶切鉴定结果

2.3 Western blot检测GPC3蛋白表达水平

以购买商业化兔抗GPC3多抗、兔抗人β-actin多抗和ANTI-FLAG抗体为一抗，进行Western blot分析鉴定，结果见图3。在阳性细胞株pCMV-gpc3/293的总蛋白提取液中，无论是用兔抗GPC3多抗还是兔抗FLAG多抗，结果中都可以看到在65 kD左右的位置上有带，而阴性细胞株pCMV-gpc3/ NC总蛋白则没有任何显色带出现，表明阳性细胞株pCMV-gpc3/293成功表达出GPC3蛋白。同时作为参照，阳性细胞株和阴性细胞株的β-actin蛋白表达基本一致。

图3 GPC3蛋白表达Western blot分析

2.4 重组蛋白的表达和纯化

将经过纯化及浓缩的重组蛋白及细胞破碎产物进行SDS-PAGE电泳，结果见图4。由于真核细胞表达外源蛋白的水平较低，为了获得一定量的重组蛋白，本研究大量培养细胞，从1014个细胞中提取纯化到0.1 mg重组蛋白，鉴于得率太低，研究组计划优化培养条件，以获得更高的得率和重组蛋白。从图4中可以看出，经过纯化及浓缩后，得到了一个分子量约为65 kD的蛋白条带，与Western blot检测一致（图5）。

3 讨论

目前，我国恶性肿瘤已经排在居民主要疾病死亡率的首位，成为影响人们健康的头号杀手。统计数据表明2010年全国恶性肿瘤发病率为235.23/10万。其中，肝癌（特别是原发性肝细胞癌）的死亡率仅次于胃癌，已经成为我国的第二大癌症［15］。发现并确定新的肝癌早期诊断、治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值［16，17］。最近，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为一种新的肝癌肿瘤标志物被国内外研究人员提出。研究人员发现GPC3在多个肿瘤组织中特异表达，特别是在肝癌中的特异性高表达，使我们看到了其成为继AFP后又一个肝癌肿瘤标志物的前景。

图4 纯化后GPC3蛋白SDS-PAGE电泳分析

图5 纯化后GPC3蛋白Western blot分析

Shirakawa等［18］利用免疫组化的方法对3种原发性肝癌（hepatocellular carcinoma HCC，intrahepatic cholangiocarcinoma ICC，combined hepatocellular and cholangiocarcinoma CHC）组织中的GPC3蛋白表达情况进行了分析，发现ICC病例组织中不表达GPC3蛋白，CHC病例中部分表达GPC3蛋白，而在HCC病例组织中大量表达78.3%（36/46），所以作者最终得出GPC3蛋白对于HCC具有特异性的结论。付顺军等［19］利用酶联免疫和化学发光的方法，对健康者、肝硬化患者和肝癌确诊病例血清中的GPC3和AFP含量进行了测定，发现健康者和肝硬化患者血清中的GPC3浓度无统计学差异。而肝癌患者血清中的GPC3浓度与健康者和肝硬化患者血清有显著的差异，表明GPC3对肝癌有较高的敏感性和特异性。当GPC3以3 μg/L，AFP以20 μg/L为诊断界限时，GPC3的敏感性要高于AFP。Akutsu等［20］利用商品化的ELISA试剂盒检测血清中的GPC3含量，发现健康者和乙肝患者的含量均低于阈值，HCC患者中有50%（32/64）的含量高于阈值，HCC的平均含量明显高于非HCC。

为了探究GPC3与肝癌的关系，获得具有自主知识产品的抗GPC3抗体，进而开发肝癌早期诊断方法，本研究成功构建了真核表达载体pCMV-gpc3。经过脂质体转染，得到能够稳定表达GPC3的细胞株。最终通过高效表达、提取和纯化等过程获得了一定量纯度较好的重组GPC3蛋白。选用真核表达载体p3XFLAG-CMV-14及HEK293细胞宿主是因为GPC3是一个糖蛋白，只有在真核细胞中进行表达，才能够最接近于其天然的状态。目前，已经有多个研究小组利用HEK293细胞无基础性表达GPC3的特性进行GPC3的相关研究［21，22］，同时p3XFLAG-CMV系统是一种高效的真核表达系统，该系统具有高效的强启动子CMV启动子，有利于目的蛋白的高效表达。并且表达的蛋白中含FLAG标签，利用FLAG亲和纯化层析柱，能够对表达产物进行纯化，且纯度非常高，有利于后续实验的进行。

4 结论

本研究成功构建了真核表达载体pCMV-gpc3。经过脂质体转染，得到能够稳定表达GPC3的细胞株。最终通过高效表达、提取和纯化等过程获得了一定量纯度较好的重组GPC3蛋白。

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（责任编辑 李楠）

Construction of Eukaryotic Expression Vector for Glypican-3 and Its Expression in Cell

CHENG Hua1FANG Xiang-dong2CUI Shuo1WU Meng1ZHANG Zhao-jun2LI Ze-xia2
（1. Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081；2. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

This work aims to construct the eukaryotic expression vector of glypican-3（GPC3）for acquiring anti-GPC3 monoclonal antibody. The GPC3 gene was amplified by PCR and was cloned into an expression vector p3XFLAG-CMV-14，and the expression vector pCMV-gpc3 was constructed. HEK293 cells were transfected with the vector by liposome，and the final results were detected by Western blot. The stably-expressed cells were collected and ground，and the high-purity GPC3 protein was obtained by affinity column. The eukaryotic expression vector of pCMV-gpc3 was constructed successfully. After the transfection to HEK293 cells，the monoclonal cell line of stablyexpressed was gained by G418 screening. Western blot analysis revealed that the target protein expressed markedly. A large number of GPC3 proteins were obtained via genetic engineering and purifying technology，which laid a foundation for the biological function and application of the protein as well as the preparation of monoclonal antibody.

glypican-3；eukaryotic expression；liposome transfection；affinity purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.019

2015-07-28

河北省科学院高层次人才资助项目（20150503LR62-9），河北省科学院科技计划项目（13335）

程华，男，副研究员，研究方向：肿瘤早期诊断及相关机理；E-mail：cheng_hua@sina.com