烤烟抗连作有益菌的筛选及其对烤烟的促生长作用

黄宇祥，徐 博，姜洪甲，邢世东，邓贵义，刘 娥，孙 羽

(丹东农业科学院，辽宁丹东 118109)

烤烟抗连作有益菌的筛选及其对烤烟的促生长作用

黄宇祥，徐 博，姜洪甲，邢世东，邓贵义，刘 娥，孙 羽

(丹东农业科学院，辽宁丹东 118109)

摘要[目的]从烟草根际筛选出具有克服连作障碍功能的目标微生物，研究目标微生物与烟草根际、病原菌、植株的互作效应。[方法]从不同烟田土壤中筛选出对克服烟草连作障碍具有显著作用的菌株，将目标微生物以拌母床土、拌假植土、蘸根假植的方式接种到烟株根系，采用小区试验观测烟株自然发病率和病情指数。[结果]A1+B1复合有益菌处理对靶斑病和角斑病的抑制效果均好于单一菌种处理。这可能是因为A1菌的主要功能是降解烟株分泌的自毒物质，B1菌的主要功能是拮抗病原菌，不同功能的2种菌复合处理能够在功能上互相扶持，弥补单一菌种功能的不足。[结论]该研究可为今后在丹东地区烤烟生产中利用有益微生物菌剂缓解烤烟连作障碍与减轻烟叶病害提供理论依据。

关键词烤烟；连作；自毒物质；降解菌；拮抗菌

丹东烟区耕地面积有限，烟叶生产无法安排合理的轮作，不可避免地长期存在烟田连作现象，严重影响烟叶的产量和品质。因此，连作障碍已成为影响丹东烤烟生产发展和烟叶品质的重要因素。烟草是最容易发生连作障碍的作物之一，其原因与自毒作用有关。目前，已经从烟草根系分泌物中分离出许多自毒物质，其中大多为酚酸类化合物[1～3]，其中以对羟基苯甲酸的自毒作用最强。这些物质通过影响细胞膜透性、酶活性、离子吸收和光合作用等各种途径来影响烟草生长[4，5]。为了进一步提高丹东烟叶的质量和工业可利用率，笔者从丹东烟田土壤筛选对羟基苯甲酸降解菌，研究其田间应用效果，旨在为缓解因连作给丹东烤烟生产带来的危害提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1培养基。①无机盐培养基：NH4NO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、(NH4)2SO40.5 g、KH2PO40.5 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41.5 g、蒸馏水 1 000 mL、对羟基苯甲酸分别为1.0～4.0 g，调节pH至7.0。②高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20 g、蒸馏水 1 000 mL；pH 7.4～7.6；加入重铬酸钾母液，并使其在培养基内的浓度为20 mg/L，抑制细菌与真菌的生长。③马丁氏培养基：KH2PO410 g、MgSO4·7H2O 5 g、蛋白胨 5 g、葡萄糖 10 g、琼脂 15～20 g、蒸馏水1 000 mL，pH 自然。加入0.1 mL/L的阿米卡星，抑制细菌和放线菌的生长。各种抑制剂均在紫外线下灭菌50 min，培养基冷却至50～60 ℃时，在超净工作台中放入抑制剂溶液中，摇匀。

1.1.2筛选菌株土样。取自丹东地区烟田土壤。

1.2试验方法

1.2.1土壤样品的采集。采用5点取样法，取0～20 cm耕层土壤，每点取500 g土壤样品。

1.2.2酚酸降解菌的筛选及初步鉴定。采用富集培养的驯化方法，取烟田土壤5 g，接种于含有1.0 g/L PA的100 mL无机盐培养基的250 mL三角瓶中，无菌膜封口，30 ℃摇床170 r/min，培养7 d后，取10 mL培养液接种于含有2.0 g/L PA的无机盐培养基中继续培养，按此依次提高培养基中PA浓度为3.0和4.0 g/L，然后进行平板涂布，将培养皿放于30 ℃ 恒温培养箱中培养72 h，挑取单菌落，纯化培养。根据镜检和菌落生长情况，对菌种进行初步鉴定，并根据菌株生长状况，筛选降解PA能力较强的菌株保存。

1.2.3靶斑病拮抗菌的筛选及初步鉴定。采用对峙培养法，在PDA平板中央接种烟草靶斑病病原菌，四周等距离2 cm处点接种，利用高氏一号培养基和马丁氏培养基筛选出的放线菌和真菌，空白对照不接筛选菌株。根据镜检和菌落生长情况，对靶斑病拮抗菌进行初步鉴定。根据各筛选菌菌落边缘与病原菌菌落边缘之间的抑菌带宽度确定拮抗程度。挑选拮抗靶斑病病原菌能力较强的菌株保存。

1.2.4有益菌菌剂的制备。菌株液体培养后利用稻壳粉吸附最终菌株的数量达到约108CFU/g，复合菌先单独制成菌剂后再进行复配，复配比例为1∶1，复配的最终菌株的数量达到约108CFU/g。

1.2.5有益菌施用方式研究。试验采用完全随机区组设计，3次重复，3行区，株距0.5 m，行距1.2 m，行长5 m，小区面积18 m2。试验以3个施用方式(拌母床土、拌母床土+蘸根假植、拌假植土)和3种有益菌处理(自毒物质降解菌A1、靶斑病拮抗菌B1、A1+B1组合)，共设置9个处理，以不施用有益菌为对照。

2结果与分析

2.1有益菌的筛选2013年在宽甸和凤城部分烟区采集的土壤样品中分离筛选出有益菌。由表1可知，其中筛选出降解PA效果较好的有4株，其中A1的降解能力最强；对靶斑病拮抗效果较好的有3株，其中B1的拮抗能力最强。制成菌剂后，用于2014年田间试验。

2.2有益菌施用方式研究

2.2.1有益菌拌母床土出苗情况调查。有益菌拌母床土在2个试验点出苗情况比较一致。其中，A1菌拌母床土出苗情况最好，与CK处理的出苗时间基本一致；A1+B1复合菌处理出苗情况次之；B1处理出苗时间较晚，与CK处理相比要晚5～7 d。这可能是因为B1菌拌母床土施用时，母床适宜的温湿度有利于其繁殖，而B1菌在快速繁殖时会产生一些促进植物的生长的类似植物激素类的物质，但是这类物质浓度过大时反而会起到抑制作用。因此，这是造成有B1菌拌母床土时出苗时间晚于CK的原因。

2.2.2不同处理对靶斑病发病率的影响。从表1可以看出，在不同施用方式、不同有益菌2因素处理中，W9处理的平均发病率最低，为9.34%，比CK处理降低6.12个百分点。这与不同施用方式与不同有益菌处理单独分析结果相一致，最佳施用方式与最佳菌种组合处理的W9处理发病率最低。

2.2.3不同处理对靶斑病情指数的影响。从表2可以看出，2个试验点各个时期不同施用方式的靶斑病的病情指数存在显著差异。其中最低的为拌假植土处理，尤其是在8月22日，与其余2种施用方式及CK处理相比有显著差异。其余2种施用方式之间以及与CK处理间没有显著差异。3种不同有益菌处理间平均病情指数最低的为A1+B1复合菌处理，但是3种不同有益菌处理与CK处理相比病情指数没有显著差异。

表1　不同处理靶斑病发病率的比较

从表3可以看出，不同施用方式不同有益菌两因素处理中，两个试验点各个时期不同处理间靶斑病病情指数存在显著差异，其中大堡8月1日和8月22日不同处理的病情指数存在极显著差异。青椅山试验点W9和W7处理的病情指数较低，大堡试验点W7和W8处理的病情指数较低。这说明拌假植土的3种处理对靶斑病有一定的抑制效果。

表2　不同施用方式及不同有益菌处理靶斑病病情指数的比较

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

2.2.4不同处理对角斑病病情指数的影响。从表4可以看出，不同施用方式中，大堡试验点8月22日与9月5日单独拌母床土与拌母床土+蘸根角斑病病情指数均极显著低于CK处理，但这2种施用方式间病情指数没有显著差异。不同有益菌处理中，大堡试验点8月22日与9月5日A1+B1复合菌处理病情指数均最低，与CK处理相比均有显著差异。

表3　不同处理靶斑病病情指数的比较

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

表4　不同施用方式及不同有益菌处理角斑病病情指数的比较

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

从表5可以看出，不同施用方式、不同有益菌2因素处理中，大堡试验点各个时期不同处理角斑病病情指数存在极显著差异，平均病情指数最低的是W4处理，该处理在大堡8月22日与9月5日调查数据中与CK存在极显著差异。

表5　不同处理角斑病病情指数的比较

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

3结论

该试验结果表明有益菌在田间不同施用方式中对靶斑病的抑制效果以拌假植土最好；对角斑病的抑制效果以拌母床土+蘸根和单独拌母床土施用时为最好。拌母床土+蘸根和单独拌母床土2种施用方式靶斑病和角斑病病情指数相当，说明蘸根施用作用不明显，其可能原因为蘸根处理时由于接种量比较少，未能有效在烟苗根系周围形成优势菌群。

A1+B1复合有益菌处理的对靶斑病与角斑病的抑制效果均好于单一菌种处理，这可能是由于A1菌主要功能为降解烟株分泌的自毒物质，B1菌的主要功能为拮抗病原菌，2种不同功能的菌复合处理能够在功能上互相扶持，弥补单一菌种功能的不足。

参考文献

[1] 石秋环，焦枫，耿伟，等.烤烟连作土壤环境中的障碍因子研究综述[J].中国烟草学报，2009，15(6)：81-84.

[2] 刘巧珍，郭芳阳，吴照辉，等.烤烟连作土壤障碍因子及防治措施[J].中国农学通报，2012，28(10)：87-90.

[3] 张继光，申国明，张久权，等.烟草连作障碍研究进展[J].中国烟草科学，2011，32(3)：95-99.

[4] 郭亚利，李明海，吴洪田，等.烤烟根系分泌物对烤烟幼苗生长和养分吸收的影响[J].植物营养与肥料学报，2007，13(3)：458-463.

[5] 陈冬梅，杨宇虹，晋艳，等.连作烤烟根际土壤自毒物质成分分析[J].草业科学，2011，28(10)：1766-1769.

Screening of the Beneifcial Bacteirum to Tobacco Anti-continuous Cropping and the Effect of Its Growth-promoting

HUANG Yu-xiang, XU Bo, JIANG Hong-jia et al

(Dandong Academy of Agricultural Sciences, Dandong, Liaoning 118109)

Abstract[Objective] The aim was to screen out target microorganisms with function of overcoming continuous cropping obstacles from the tobacco Rhizosphere, study interaction effect between microorganisms and tobacco Rhizosphere, pathogenic bacteria and plants. [Method] The strains with significant effects of overcoming continuous cropping obstacles were selected, the target microorganisms were innoculated on tobacco roots through ways of mixed with primary bed soil, mixed with temporary soil, root dipping and heeling in, the morbidity and disease index of tobacco was observed by plot experiment. [Result] A1+B1 composite beneficial bacterium’ inhibition effect on target spot and angular leaf spot was better than single bacteria. The main function of A1 bacteria was to degrade auto-toxic substances secreted by tobacco plants, and the main function of B1 bacteria was to prevent pathogenic bacteria. Different functions of two bacterium could make up for the deficiency of single bacteria function. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for using beneficial bacterium in continous cropping tobacco field in Dandong and reduce tobacco leaf disease.

Key wordsFlue-cured tobacco; Continuous cropping; Auto-toxic chemicals; Degrading bacteria; Antaganistic bacteria

作者简介黄宇祥(1981- )，男，辽宁凤城人，研究实习员，硕士，从事植物营养研究。

收稿日期2016-03-15

中图分类号S 572

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-026-03