北京地区犬细小病毒流行特性分析

张伟伟，张兆霞，孙艳争，于咏兰（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）



北京地区犬细小病毒流行特性分析

张伟伟，张兆霞，孙艳争，于咏兰
（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）

摘要：为了解北京地区犬细小病毒（CPV）流行特性，采用PCR技术对1 209份犬粪便进行CPV检测。对获得的犬细小病毒的VP2片段进行扩增后再测序分析，并对感染犬的转归进行跟踪回访。结果表明，CPV阳性样本232份（19.2%），其中CPV-2a占62.1%，CPV-2b占37.9%，未发现CPV-2和CPV-2c。CPV-2b较CPV-2a更易感染0～3月龄犬（P＜0.05），且CPV-2b感染犬死亡率显著高于CPV-2a感染犬（P＜0.05）。

关键词：犬细小病毒（CPV）；VP2；死亡率

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）为无囊膜单股DNA病毒。目前世界各地犬群中流行的犬细小病毒抗原型主要包括CPV-2a、CPV-2b及CPV-2c，有研究表明，CPV突变株较原始CPV-2毒株致病力更强、宿主范围更广［1-2］。关于CPV-2a、CPV-2b及CPV-2c之间的差异性的研究，目前还很少。为了解北京地区CPV流行情况，比较北京地区CPV-2a及CPV-2b的流行特性，本试验对1 209份犬粪便进行CPV检测，并对检测出的232份粪便中的CPV进行分型，对临床感染病例进行了跟踪回访，为进一步研究比较CPV-2a及CPV-2b的致病性提供参考。

1　材料与方法

1.1粪便样本2012-2013年间于中国农业大学动物医院采集到粪便1 209份。

1.2试剂2xPCR Super TaqMix、DL-2 000 Plus Marker，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3引物以CPV-b（Gen Bank accession no.M38248）为参考，设计能够同时扩增出CPV基因组3909、4062 及4064多态性基因位点的引物。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

上游引物A：5′-TTGAGGCGTCTACACAAGGG-3′

下游引物B：5′-GGATTCCAAGTATGAGAGGCTC-3′

1.4模板制备煮沸法［3］：取临床收集粪便样本100 μL与900 μL生理盐水混合，1 157 r/min离心10 min，取上清液；对上清液进行沸水浴10 min，冰浴10 min，18 514 r/min离心10 min，取上清，用无菌双蒸水做1∶10倍稀释，作为PCR反应模板。

1.5PCR扩增反应体系25 μL：2xPCR Taq Mix 12.5 μL、上、下游引物（0.01 mol/L）各1 μL、DNA模板5 μL、无菌双蒸水5.5 μL；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，5个循环，95℃变性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min。

1.6PCR产物测序PCR产物送至北京三博远志生物技术有限责任公司进行扩增片段的核苷酸序列测定。

1.7粪便中CPV检测利用1.4、1.5中介绍的方法对收集到的粪便样本进行CPV检测，对阳性样本中的CPV的VP2片段进行核苷酸序列测定，并与参考毒株CPV-2（GenBank accession no.M38245）进行比对，根据相似度，判定其是否为CPV。

1.8CPV分型利用DANStar软件的Editseq模块将所得核苷酸序列翻译成氨基酸序列，再利用MegAlign模块，将氨基酸序列与参考毒株CPV-2 （GenBank accession no.M38245）、CPV-2a（M24003）、CPV-2b（M74849）及CPV-2c（FJ222821）进行比对，比较CPV的VP2 375位点及426位点对应的氨基酸差异，进行分型。

1.9CPV流行特性分析根据病毒分型结果及采集到的样本信息，按照性别、年龄、免疫状况进行分组。应用SPSS 17.0统计软件对不同抗原型病毒流行情况进行分析比较。

2　结果

2.1CPV阳性率经检测1 209份犬粪便样本中，CPV阳性样本232份，CPV阴性样本977份，阳性率19.2%。

2.2不同抗原型CPV分布状况CPV分型结果表明：144份（62.1%）为CPV-2a，88份（37.9%）为CPV-2b，未发现CPV-2及CPV-2c。

2.3CPV-2a及CPV-2b感染犬群性别组成分析

CPV-2a感染的犬群与CPV-2b感染的犬群，性别组成无显著差异（P＞0.05）（表1）。

表1　不同抗原型CPV感染犬群性别组成

2.4CPV-2a及CPV-2b感染犬群年龄组成分析

对感染CPV-2a和CPV-2b的犬群进行年龄组成分析，经卡方检验P＜0.05，两犬群年龄组成上存在显著差异。由表2可知，两种抗原型CPV均易感染0～3月龄犬，并且CPV-2b比CPV-2a更易感染该年龄段的幼犬。

表2　不同抗原型感染犬群年龄分布

2.5CPV-2a及CPV-2b感染犬免疫状况分析本试验根据免疫状况将感染犬群分为完全免疫、不完全免疫及未免疫3组，其中完全免疫是指按照推荐的免疫程序进行了免疫，未完全免疫是指进行了免疫但是未完成完整的免疫程序，例如只注射了1次或2次疫苗，未免疫是指完全没有注射过疫苗［4］。对CPV-2a和CPV-2b感染的犬群的免疫状况进行分析，结果见表3，CPV-2a感染的犬群中完全免疫犬占20.1%，其他均为不完全免疫犬和未免疫犬。而CPV-2b感染的犬群中完全免疫犬也只占到了20.5%，对两组犬群中不同免疫状况犬的分布情况进行比较，卡方检验P＞0.05，二者无显著差异。综上，两种抗原型CPV均易感染不完全免疫犬和未免疫犬。

表3　不同抗原型CPV感染犬群免疫状况

2.6CPV-2a及CPV-2b感染犬治愈率比较为了进一步了解CPV-2a与CPV-2b感染犬的转归情况，对感染犬进行回访，可获得确切转归的CPV-2a感染犬78例，CPV-2b感染犬44例。结果见表4，由表4可知CPV-2b感染的犬死亡率为61.4%，而CPV-2a感染的犬死亡率仅为33.3%，经卡方检验，P＜0.05，说明感染不同抗原型CPV犬死亡率存在显著差异。

表4　不同抗原型CPV感染犬治愈率

3　讨论

本研究首次对北京地区流行的不同抗原型CPV的流行特性进行了比较。2012-2013年间北京地区犬群CPV感染率与2011-2012年相比有所上升，并且仍处于较高的水平［5］。本次试验所获得CPV阳性样本中CPV-2a占62.1%，CPV-2b占37.9%，未发现CPV-2及CPV-2c，这与我国各地流行病学调查相符，目前我国以CPV-2a和CPV-2b为主要流行毒株，并且CPV-2a所占比例高于CPV-2b［5-8］。

统计分析表明：CPV-2a感染的犬群和CPV-2b感染的犬群在性别组成上无显著差异。CPV-2b感染的犬群中0～3月龄犬所占比例显著高于CPV-2a感染的犬群中0～3月龄犬所占比例，这说明CPV-2b较CPV-2a更易感染该年龄段的犬。感染犬群中0～3月龄犬所占比例较高，这是由于幼犬在4～12周龄时，母源抗体逐渐下降到保护效价（HI≥1∶80）以下，此时幼犬针对CPV的获得性免疫还未建立，处于免疫空白期，因此这一时期的幼犬更易感染CPV［9］。

对CPV-2a及CPV-2b感染的犬群的免疫状况进行分析，相对于完全免疫犬，两组犬群中不完全免疫犬及未免疫犬占有较高的比例。目前临床应用的疫苗大多为CPV-2弱毒株疫苗，虽然相关试验已经证明，弱毒株疫苗可以使犬产生有效的免疫力，但是CPV本身一直处于不断的变异中，有可能导致免疫失败的发生［10-11］。

不同抗原型CPV感染犬后，犬死亡率有显著差异，该结果对于犬感染CPV后的预后有很重要的提示意义。本研究发现CPV-2b感染的犬死亡率高于CPV-2a感染的犬，这与Moon等人的研究结果有所差异，但是关于病毒毒力与流行性关系的研究指出，自然选择倾向于降低病毒的毒力，因为只表现出轻微临床症状或者无临床症状的宿主可以有效地传播病毒，这一理论很好地解释了CPV-2a的致死率低于CPV-2b，流行率却高于CPV-2b［12-13］。

综上所述，北京地区流行CPV抗原型毒株主要为CPV-2a和CPV-2b，且两种毒株流行特性上存在一定的差异：CPV-2b较CPV-2a更易感染0～3月龄犬，且CPV-2b感染犬死亡率高于CPV-2a感染犬。

参考文献：

［1］Parrish C R，Aquadro C F，Strassheim M L.Rapid antigenic-type replacement and DNA sequence evolution of canine parvovirus［J］. Virol，1991，65（12）：6544-6552.

［2］Decaro N，Buonavoglia C.Canine parvovirus-a review of epidemiological and diagnostic aspects，with emphasis on type 2c［J］. Vet Microbiol，2012，155（1）：1-12.

［3］Schunck B，Kraft W，Truyen U.A simple touch-down polymerase chain reaction for the detection of canine parvovirus and feline panleukopenia virus in feces［J］. J Virol Methods，1995，55（3）：427-433.

［4］Paul M A，Carmichael L E，Childers H . AAHA canine vaccine guidelines- report of the American Animal Hospital Association （AAHA）Canine Vaccine Task Force［J］.J Am Anim Hosp Assoc，2003，39（2）：119-131.

［5］柏丽华.北京地区犬细小病毒病的分子流行病学调查研究［D］.北京：中国农业科学院，2011.

［6］魏巍.杭州地区犬细小病毒血清及分子流行病学研究［D］.杭州：浙江大学，2008.

［7］杨晓农，张焕容，杨发龙，等.成都地区犬细小病毒VP2基因克隆分析及基因型鉴定［J］.中国畜牧兽医，2011，38（9）：105-110.

［8］张仁舟.犬细小病毒分离鉴定及遗传进化分析［D］.北京：中国人民解放军军事医学科学院，2010.

［9］Lamm C G，Rezabek G B . Parvovirus infection in domestic companion animals［J］.Vet Clin North Am Small Anim Pract，2008，38 （4）：837-850.

［10］De Cramer K G，Stylianides E，van Vuuren M.Efficacy of vaccination at 4 and 6 weeks in the control of canine parvovirus［J］.Vet Microbiol，2011，149（1-2）：126-132.

［11］Schultz R D，Thiel B，Mukhtar E，et al.Age and long-term protective immunity in dogs and cats［J］. J Comp Pathol，2010，142 （1）：102-108.

［12］Moon H S，Lee S A，Lee S G，et al.Comparison of the pathogenicity in three different Korean canine parvovirus 2（CPV-2）isolates［J］.Vet Microbiol，2008，131（1-2）：47-56.

［13］Lipsitch M，Moxon E R . Virulence and transmissibility of pathogens: what is the relationship［J］.Trends Microbiol，1997，5（1）：31-37.

Epidemiological features of Canine Parvovirus（CPV）in Beijing，China

ZHANG Wei-wei，ZHANG Zhao-xia，SUN Yan-zheng，YU Yong-lan
（College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：A total of 1209 canine fecal samples were detected by PCR for CPV.The sequences of the PCR products were compared with the reported CPV isolates in GenBank to analyze the epidemiological features of CPV in Beijing，China.Clinical reviews of infected dogs were also carried out.The results showed that 232（19.2%）samples were positive for CPV.62.1%of viruses were CPV-2a and 37.9%were CPV-2b.CPV-2 and CPV-2c were not found.Compared with CPV-2a，CPV-2b tended to infect younger puppies（0～3 month-old）and the mortality rate of dogs infected by CPV-2b was significantly higher than dogs infected by CPV-2a（P＜0.05）.

Key words：canine parvovirus（CPV）；VP2；mortality rate

中图分类号：S852.65+9.2

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0082- 03

收稿日期：2014-12-22

基金项目：中农大动物医院科研基金

作者简介：张伟伟（1987-），女，硕士，主要从事小动物病毒病研究，E-mail：zhangweiweidream@126.com

通讯作者：于咏兰，E-mail：yylpurple@126.com；孙艳争，E-mail：sunyanzheng2580@163.com

Corresponding authors：YU Yong-lan；SUN Yan-zheng