miRNAs与肿瘤

黄帅，郭慧慧，王璐璐，韩燕星，蒋建东



miRNAs与肿瘤

黄帅，郭慧慧，王璐璐，韩燕星，蒋建东

作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所（黄帅、郭慧慧、王璐璐、韩燕星、蒋建东），医药生物技术研究所（黄帅、蒋建东）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长 19 ～ 24 nt 的单链、内源性非编码 RNA，其序列高度保守。成熟 miRNA的转录生成首先是在细胞核内经 RNA 多聚酶 II 和（或）多聚酶 III 的作用形成初始 miRNA（pri-miRNA），然后在核内切酶 Drosha Rnase III 作用下，去除 pri-miRNA 的5'-cap 和 3'-poly（A） 结构形成含茎环结构的前体 miRNA （pre-miRNA），再经由 Ran-GTP/Exportin-5 受体将pre-miRNA 从核内输出到细胞质，在胞质经 Dicer 酶和解螺旋酶作用后形成单链成熟 miRNA；成熟 miRNA 被RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）如 Argonaute 核蛋白家族包裹，形成 miRNA 沉默复合体（miRNP），miRNP 可以与靶基因 mRNA 的 3'-UTR互补配对，使 mRNA 发生降解或转录抑制，发挥转录后水平调控作用［1］。单一 miRNA 可调控多个靶基因，一个靶基因也可由多个 miRNAs 共同调控，这些靶基因大多数参与了机体分化，细胞增殖、凋亡、代谢等生理过程。最新研究还发现另一类内源性长非编码 RNA（long uncoding RNA，lncRNA）可调控靶基因 mRNA 表达，也可作为竞争性内源 RNA（ceRNA）拮抗 miRNA 的转录抑制作用［2］（图1）。

最早报道 miRNA 是在 1993 年，科学家在秀丽短杆线虫体内得到，分析发现它包含约 21 个非编码核苷酸序列，部分序列能与 lin-14 mRNA 的 3'-UTR 互补配对结合，抑制 lin14 蛋白合成，取名为 lin-4［3-4］。后来研究发现，miRNAs 在多种动植物体内都存在，截至 2014 年 6 月，miRBase 数据库报道的 miRNAs 总数已达 28 645 个。越来越多的研究证实，在人类多种疾病如肿瘤、心血管疾病和代谢性疾病等病理过程中，miRNAs 的表达均出现异常。

可以说 miRNAs 参与了肿瘤整个发生、发展过程，它与肿瘤细胞增殖、分化、侵袭、分布及自噬凋亡、肿瘤血管形成、肿瘤微环境代谢和干细胞分化等有着密切关系。miRNAs 可作为肿瘤抑制因子，影响调节癌蛋白如 MYC、RAS、HMG1、BCL-2 等的表达，产生肿瘤抑制作用，如 let-7可以抑制 RAS 基因而发挥肿瘤抑制作用；miRNAs 也可作为肿瘤因子调控抑癌蛋白如 p53、p21、BAX 等的表达，促进肿瘤的发生，如 BIC/miR-155 可抑制 BCl-2 蛋白表达，转换成为致瘤基因［5］。此外，miRNAs 同时在机体肿瘤免疫调节和基因修复机制中也发挥着重要作用。本文对与几种重要肿瘤密切相关的 miRNAs 作一综述。

图1　miRNA 的成熟过程及作用机制

1　白血病相关 miRNAs

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是发生在成年人中最常见的一类白血病，其中 miRNAs 参与肿瘤发生的报道最早见于 CLL。急性髓系白血病（AML）也是成人中最常见的急性白血病，目前已报道多个 miRNAs与 AML 的发生密切相关。

1.1慢性淋巴细胞白血病

1.1.1miR-15/16 簇miR-15/16 成簇定位在 13q14.3 基因中，而大多数的 CLL 病例中出现 13q14.3 基因缺失，因此， miR-15 和 miR-16 呈现缺失表达。miR-15/16 簇可作用到靶基因 BCL-2 的 3'-UTR，抑制 BCL-2 的表达，BCL-2 作为促癌基因可以拮抗肿瘤细胞的凋亡，在多种白血病、淋巴瘤等中高表达。同时，miR-16 能够识别结合 AU序列富集区域，通过与靶基因如 MCL1、WNT3A、CCND 和CCNE 的结合区互补配对，影响周期蛋白稳定性，减少其转录表达。因此，miR-15/16 簇作为肿瘤抑制因子发挥作用［6］。

将转染 miR-15/16 表达载体的MEG-01细胞株移植到裸鼠皮下，发现过表达 miR-15/16 后使得 MEG-01 肿瘤细胞的植入生长明显受到抑制，检测 PDCD4、RAB21、IGSF4、SCAP2 和 BCL-2 的 mRNA 和蛋白表达均降低［7］；分别过表达 miR-15 或 miR-16 后可使 TP53 表达量降低 52% 和 62%，miR-15/16 同时高表达可使 TP53 表达量减少 82%。同时有研究发现，在 13 号染色体和 3 号染色体上，miR-15/16 簇的两个同源物（miR-15a/16-1 和miR-15b/16-2）的上游区存在 TP53 的结合位点，TP53 可直接激活 miR-15/16 簇两个同源物的转录表达［8］。

1.1.2miR-150对 CLL 患者的淋巴结组织进行 miRNA原位杂交，发现 miR-150 在淋巴细胞增殖中心区（PC）的外周表达量高，而在 PC 区域几乎无表达［9］。与健康人相比，在 CLL 患者的 B 细胞和血清中，miR-150 均上调表达，且在细胞和血清中 miR-150 的高表达状态与肿瘤恶性程度大、预后差具有相关性。这是由于大量淋巴细胞循环进入血液，使血清中 miR-150 水平高［10］。高表达 miR-150 同时可抑制调节 GRB2 相关结合蛋白 1（GAB1）和叉头蛋白P1（FOXP1）的表达，GAB1 和 FOXP1 是 B 细胞受体信号分子，决定了 B 细胞的存活和增殖。因此，miR-150 是CLL 重要的肿瘤抑制性 miRNA 和预后诊断标志物［11］。

1.2急性髓系白血病

1.2.1miR-155利用多变量 Cox 模型分析发现，AML患者血清 miR-155 的高表达与总生存率差具有相关性［12］。MiR-155 作用到靶基因如 PU.1、JUN 和 CEBP-β，可抑制髓系细胞分化。在 FMS 样酪氨酸激酶受体 3（FLT3）突变的 AML 患者血清中，miR-155 上调表达 8.353 倍，而分化基因 PU.1、JUN、CEBP-β 表达分别下调 0.36%、0.22% 和 0.26%［13-14］。一些天然结构改造化合物，如 silvestrol 可以降低 FLT3 的表达，间接抑制 miR-155 水平，发挥抗髓细胞瘤活性［15］。此外，由于 miR-155 的宿主基因上游存在两个 p65 和一个 STAT5 的结合位点，作为癌基因miR-155 受到 NF-κB（p65）和 STAT5 的调控，激活 p65或同时转染 STAT5 能够启动 miR-155 的表达，使髓细胞分化受抑制，促进癌细胞的增殖和存活［16］。

1.2.2miR-181分析 30 例 AML 血样标本发现，miR-181a 的表达与急性髓系白血病的形态分型具有一定相关性，在 M4 和 M5 型中 miR-181 的表达水平低于 M1 和 M2 型。miR-181a 的表达与急性髓系的基因分型也有相关性，相比基因正常型（CN-AML），在基因异常型急性髓系白血病（CA-AML）中，miR-181 呈高表达。因此，miR-181可作为 AML 分类的标志物［17］。

MiR-181 也是 AML 诊断预后的标志物，低表达miR-181 的 CN-AML 患者总生存期较长和无疾病事件生存率高，是良好预后的重要标志。而在 CA-AML 患者中，miR-181 高表达是预后良好的重要标志，这与 miR-181 调控靶基因 HOXA7、HOXA9、HOXA11 和 PBX3 的表达有关。HOXAs 和 PBX3 代表着 AML 预后不良，总生存期短。过表达 miR-181 可降低内源性的 HOXAs 和 PBX3的表达。MiR-181 还可以抑制白血病细胞的存活和增殖，促进其凋亡，延长白血病的发生周期，抑制白血病的发生和进展［18］。

也有报道称 miR-181 可抑制调节白血病抑制因子（LIF）表达，LIF 在人类胚胎移植中起重要作用，可影响卵巢功能，降低受孕率。Emx2 能结合到 miR-181 的启动子区域，转录激活 miR-181 表达，因而通过抑制 Emx2 的表达，可直接升高 LIF 水平［19］。同时由于 miR-181 也能够降低靶基因 PRKCD、CTDSPL 和 CAMKK1 水平，使髓系细胞的分化受到抑制。因此采取降低 miR-181 表达，诱导髓系细胞分化也是治疗 AML 的新策略［20］。

2　实体肿瘤相关 miRNAs

2.1肺癌

在全世界范围内肺癌致死率高，5 年总生存率仅有15%。其生存率与诊断时间密切相关，多数患者诊断时已到晚期，因此寻找早期诊断标志物对于提高患者生存率具有重要意义。研究者们发现，miRNAs 可作为肺癌早期诊断的标志物，包括其在血清、血浆、组织、分泌物等中的表达。

2.1.1Let-7 家族Let-7 家族共有 12 个同源物，Takamizawa 等［21］首次发现 let-7 家族在肺癌组织中低表达。选用 20 种肺癌细胞株检测发现，其中的 12 株（60%）细胞 let-7 的降低幅度大于 80%。同样，在 16 例术后患者肺癌组织中有 7 例（44%）let-7 的降低幅度大于 80%。此外，let-7 的低表达与肺癌患者术后生存期缩短也有一定的相关性（P = 0.03）。

通过构建载体体外过表达 let-7 家族，能够抑制肺癌细胞生长，利用体外转染过表达 let-7 的 A549和 H460 细胞株建立肺癌移植瘤模型，证实 let-7 能够减缓肿瘤的生长。这是由于 let-7 通过减少靶蛋白 G12D 表达，导致 Kras癌基因发生突变概率降低［22］。另一方面，RAS 蛋白在肺癌组织中高度表达，分析发现，RAS mRNA 的 3'-UTR 存在let-7 的互补序列。通过体外双荧光素酶报告实验证实，let-7可调控 RAS 的表达，因此可以认为，let-7 作为抑制性miRNA，抑制 RAS 靶蛋白表达，进而抑制细胞增殖，影响肺癌的发生［23］。

2.1.2miR-138与非小细胞肺癌癌旁组织相比，肿瘤组织中 miR-138 低表达，与体外肺癌细胞株中表达一致。MiR-138 可作用于靶基因 EZH2 介导抑制肺癌细胞增殖，引起细胞 G1/S 周期阻滞，诱导凋亡，发挥抑制肿瘤活性［24］。EZH2 是一种甲基化蛋白，在致癌剂尿烷诱导的小鼠肺癌模型中同样显著性高表达［25］。同时，miR-138 也能够作用到 H2AX，致使肺癌细胞的 DNA 损伤修复能力受到严重破坏［26］。

血清中的 miR-138 水平可作为非小细胞肺癌预后诊断标志物。miR-138 可通过靶向 3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶 1（PDK1）抑制肿瘤细胞的代谢、增殖和存活。在 100 名非小细胞肺癌患者血清中，miR-138 表达显著低于正常人血清水平［（2.47 ± 1.23）vs（4.46 ± 1.32），P ＜ 0.001］，相反，PDK1 的表达显著升高［（3.90 ± 1.38）vs（1.13 ± 0.34），P ＜0.001］，miR-138 低表达且 PDK1 高表达的患者占 48%，这部分患者的总生存数是最少的［27］。

此外，血清中的 miR-138 水平可能还与某些治疗的敏感性相关。在吉非替尼耐药模型株 PC9GR 里，miR-138 呈现低表达，而 G 蛋白偶联受体 124（GPR124）高表达，两者同时影响 PC9GR 对吉非替尼敏感性。miR-138-5p 能够抑制 GPR124 表达，降低 GPR124 的表达或升高miR-138，可有效克服吉非替尼耐药出现［28］。此外，miR-138还可以抑制 SENP1 表达，改善放射性治疗的敏感性［29］。

2.2肝癌

肝癌是致死率位居第二的癌症，其发病因素包括酒精性和非酒精性脂肪肝、遗传性因素和 HBV、HCV 长期慢性感染引发的肝炎等。

2.2.1miR-34a采用 75 份临床肝癌组织标本验证分析发现，miR-34a 的表达显著降低，且与端粒酶的活性和端粒长度具有一定的相关性。体外实验发现，过表达 miR-34a 能抑制端粒酶活性，缩减端粒长度，迫使细胞呈现衰老表型，这是由于 miR-34a 作用到靶基因 c-MYC 和 FOXM1，这两个基因参与了活化维持端粒长度和细胞稳态所必需的端粒逆转录酶的转录过程，因而使 miR-34a 间接抑制端粒逆转录酶的生成［30］。

在肝癌细胞，如 Huh7、HepG2 和 Bel7402 中，过表达 miR-34a 能够同时降低 CDK6、CCND1、FOXP1、c-MET 和 CCNE 水平，引起细胞周期阻滞，抑制细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞衰老和凋亡［31-32］。某些小分子化合物可通过 miR-34a 介导其抗肿瘤活性。如 Rubone 可作为miR-34a 的调节子，增强 p53 与 miR-34a 启动子区域的亲和力，升高 miR-34a 的表达；而在 p53 基因敲除的 Hep3b肝癌细胞株中，Rubone 的抗肿瘤活性消失，也证实了Rubone 的抗肿瘤活性与 p53 基因及其调控的 miR-34a相关［33］。

2.2.2miR-21与人肝癌癌旁组织相比，肝癌组织中高表达 miR-21。高表达 miR-21 的肝癌患者 5 年生存率低，仅有 40.2%，而低表达 miR-21 的肝癌患者为 70.7%，且高表达组患者的 5 年无瘤生存期也相对较短，为 17.4%，而低表达组患者为 57.3%。

与原代正常肝细胞相比，肝癌细胞中 miR-21 和HMGB1 同时高表达，并证实 HMGB1 可依赖 IL-6/STAT3信号途径激活调控 miR-21 的表达。升高 miR-21 水平能够抑制 RECKs 和 TIMP3 的表达，后两者是基质金属蛋白酶（MMP）的抑制剂，所以 miR-21 的水平升高间接抑制了肿瘤细胞的侵袭和迁移［34］。

在肝癌患者（30 例）的血清外泌体中，miR-21 的表达显著高于正常人（5.57 倍）的水平，同时高于无外泌体的血清和全血清中的水平（1.62 倍和 3.98 倍）。这种高表达与肝癌临床病理分级具有一定的相关性，但与年龄、性别和有无 HBV 感染无关［35］。

同时，miR-21 通过靶向 Aurora-A 激酶，可降低细胞毒类化疗药物在肝癌治疗中的敏感性。Aurora-A 是促进有丝分裂纺锤体的中心体复制和分离的激酶之一，沉默Aurora-A 也能够同时降低 miR-21 表达。由于 miR-21 抑制 PTEN 的表达，消除 PTEN 对 PI3K/Akt 信号通路的负调控作用，使得 PI3K/Akt 通路激活，间接导致 BCL-2 家族蛋白表达减少，影响肝癌细胞凋亡。同时还发现，NF-κB激活 miR-21 启动子区域，促进 miR-21 表达［36］。

在中国，HBV 感染是诱发导致肝癌的主要因素之一，这是由于 HBV 自身编码的 X 蛋白（HBx）通过上调 IL-6磷酸化激活转录因子 STAT3，引起 miR-21 高表达，从而促进肝癌发生［37］。

3　其他肿瘤相关 miRNAs

3.1miR-143/145 家族

miR-143/145 家族在多种肿瘤中发挥重要抑瘤作用。有研究证实，在乳腺癌、结肠癌中，miR-143/145几乎无表达，这是由于 Dicer 酶在转录后水平调控 pre-miRNA 成熟的过程被阻断，直接降低了 miR-143/145 表达。通过体外过表达 miR-143/145，可降低靶基因 ERBB3 的表达，抑制乳腺癌的生长和侵袭；也可减少 IGF1R 的表达，抑制结肠癌细胞的生长［38-39］。在子宫内膜癌组织中，miR-143/145 家族呈下调表达，而其靶基因 DNA 甲基化转移酶 3B （DNMT3B）呈高表达，预示了子宫内膜癌预后诊断差［40］。在脂肪瘤组织中 miR-143/145 家族也是低表达的，过表达miR-143/145 可通过影响细胞周期调控，诱导瘤细胞凋亡，抑制脂肪瘤的生长［41］。

3.2miR-124

抑制性肝细胞核因子 4α（HNF4α）是能够导致肝癌的一类细胞因子，通过结合到 miR-124 的启动子区域，启动miR-124 的表达。升高 miR-124 可以通过降低靶基因IL6R 水平，间接影响 STAT3 活性［42］。在胶质瘤中 miR-124可调节 PTBP1 的表达，诱导祖细胞分化成熟［43］。同时，miR-124 可以协同 miR-147 和 miR-193 作用于 EGFR驱动的细胞周期网络相关蛋白如 RB1、p27、CDK4 等，影响乳腺癌细胞周期分裂和增殖［44］。

表1　几种重要的肿瘤相关 miRNAs

4　展望

综上所述，无论是作为诊断标志物还是未来用作治疗工具，miRNAs 在肿瘤中都发挥着重要作用。由于不同miRNAs 在各类肿瘤的表达及其作用靶点存在差异，决定了其发挥的作用不同（表1）。如前述，miR-181 可作为 AML分类和预后诊断的标记物，miR-138 是非小细胞肺癌的预后诊断标记物，也是肿瘤治疗耐药的标记物。目前，在精准医疗新形势指导下，探寻研发用于诊治肿瘤的生物类药物或调控 miRNAs 的低毒性天然活性类药物势必会成为研究者们关注的热点。由于肿瘤疾病的复杂性和多样性，且对其发生预警、发病因素、病理机制、诊断分类和治疗方案的研究尚未完全明确，这也就决定了肿瘤的诊断和治疗比较棘手。miRNAs 作为内源性物质，在机体自身发育、分化和疾病发生过程中发挥作用，标志性 miRNAs 能够及早提示机体的状态变化，受低毒性天然活性类药物调控性 miRNAs 或直接治疗性 miRNAs 能够逃脱机体免疫反应，展现出良好的治疗效果。同时鉴于 miRNAs 的组织分布广泛性和作用多靶点的特性，决定了其对研究或治疗各因素导致的肿瘤、开发新的抗肿瘤药物、延长患者的生存时间和总生存率具有重要的临床意义。

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技术与方法

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.013

基金项目：创新药物非临床药物代谢及药代/药效研究北京市重点实验室（Z141102004414062）

通信作者：韩燕星，Email：hanyanxing@imm.ac.cn；蒋建东，Email：jiang.jdong@163.com

收稿日期：2016-03-04