β细胞素下调对肝癌细胞增殖能力的影响及其机制探讨*

第四军医大学西京医院肝胆胰脾外科(西安710032)　李　军　白　娟　窦科峰　安家泽



β细胞素下调对肝癌细胞增殖能力的影响及其机制探讨*

第四军医大学西京医院肝胆胰脾外科(西安710032)李军△白娟◇窦科峰安家泽▲

摘要目的：在肝癌细胞系中通过下调β细胞素 (BTC)的表达研究其对肝癌细胞侵袭能力的影响并探究其影响机制。方法：通过siRNA转染下调BTC后,通过Transwell侵袭实验检测SMMC7721和MHCC97-H细胞的侵袭能力变化，并用RT-PCR和Western blot检测与肝癌侵袭能力相关的PI3K/AKT-XIAP信号通路的表达变化。结果：与阴性对照组相比,siRNA下调组中SMMC7721和MHCC97-H细胞的侵袭能力明显降低，PI3K/AKT-XIAP信号通路受到明显抑制。结论：下调BTC表达可能通过抑制PI3K/AKT-XIAP信号通路抑制肝癌细胞的侵袭能力。

主题词肝肿瘤细胞增殖 β细胞素 肿瘤抑制蛋白质类

肝癌是目前世界范围内发病率居第6位[1]，致死率居第2位的恶性肿瘤。我国的肝癌形势尤为严峻，占全球肝癌发病人数和死亡人数的一半以上[2]。为改善肝癌治疗现状，肝癌侵袭、转移机制一直是研究的热点问题。作为表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)家族中的一个成员,β细胞素(Betacellulin,BTC)在肿瘤的机制研究中日益受到重视,BTC在肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌组织中都有较高的表达[3]。本课题组前期的研究发现BTC的高表达与肝癌组织的病理特征密切相关，提示BTC与肝癌的侵袭、转移相关[3]。但目前关于BTC调控肝癌侵袭、转移的机制尚不清楚。因此,本研究通过siRNA转染的方式在肝癌细胞系MHCC97-H和SMCC7721中下调BTC的表达,进而研究下调BTC对肝癌细胞侵袭能力的影响并进行机制探索。

材料和方法

1材料①肝癌细胞系：人肝癌细胞系SMMC-7721、MHCC97-H。②实验试剂：DMEM培养基；磷酸缓冲液(PBS)；FBS；0.25%胰蛋白酶；DMSO；注射用链霉素粉针剂；注射用氨苄青霉素粉针剂；重组人BTC蛋白。BTC inhibitors 及其阴性对照NC，脂质体2000。反转录试剂盒、DEPC纯水；rTaq酶、Trizol(美国Invitrogen公司)；DNA marker、DNA Loading buffer(中国大连Takara公司)，SYBRPremix EX Taq荧光实时定量(RT)试剂盒；三氯甲烷、二甲基甲醇、99.97%的Alcohol(天津永大化学制剂公司)；琼胶糖(上海泽迈生物技术有限公司)。鼠抗人BTC多克隆一抗(美国Cell Signaling Technology试剂公司);鼠抗人β-actin多克隆一抗(美国Cell Signaling Technology试剂公司)；鼠抗人MMP-2多克隆一抗(美国Cell Signaling Technology试剂公司)，鼠抗人MMP-9多克隆一抗(美国Cell Signaling Technology试剂公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(美 国 Cell Signaling Technology试剂公司)；鼠抗IXAP多克隆一抗(美国Cell Signaling Technology试剂公司)；细胞裂解液；硝酸纤维膜(Millipore 中国有限公司)；5X蛋白上样缓冲液(中国)； 10X电泳缓冲液；TBS-T漂洗液。Matrigel胶(BD公司)；transwell小室(美国Millipore公司)。

2方法①细胞培养：肝癌细胞株SMMC7721和MHCC97-H在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基中于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。②RT-PCR：mRNA提取采用Takara公司RNAiso Plus(Total RNA提取试剂) 并按其说明进行操作，反转录采用Takara公司反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix并按其说明书进行操作，RT-PCR在Bio-Rad公司IQ5 实时定量PCR仪上进行，采用Takara公司的PCR试剂盒SYBR Premix EX TaqTMII并按其说明进行操作。所用到的引物序列(5’-3’)：BTC正CCTGGGTCTAGTGATCCTTCA, BTC反CTTTCCGCTTTGATTGTGTGG，XIAP正GGG AAC AAC ATGCTAAATGG，XIAP反CTGCAACCAGAACCT CAAGT，β-actin正CATGTACGTTGCTATCCAGGC，β-actin反CTCCTTAATGTCACGCACGAT。③Western blot：取铺满培养皿底约80%～90%的细胞，4℃PBS清洗后加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解细胞，12000rpm离心10min吸取上清，留样测定蛋白浓度，其余加入等体积2XSDS蛋白上样缓冲液并煮沸5min准备电泳。按照碧云天公司蛋白凝胶配置试剂盒说明书配胶并上样，120V电泳结束后以横流170 mA,2 h的条件湿转蛋白至PVDF膜,含5%BSA的TBST封闭1 h，按说明书建议浓度稀释一抗并于 4℃摇床摇晃过夜孵育,TBST洗涤5min×3次,以辣根过氧化物酶标记的二抗室温下缓慢摇晃孵育1h，TBST洗涤5 min×3次。使用Millipore公司增强型ECL化学发光试剂盒在Bio-RAD公司ChemicalDocTM XRS+显影仪上发光显影,并用Image Lab软件对图像进行分析。④siRNA转染：转染分为3组：FAM-对照组：转染时加FAM -inhibitors control+脂质体2000，该组用来检测转染效率，不再进行后续实验；实验组：转染时加入BTC inhibitors(IB)+脂质体2000；阴性对照组：转染时加入阴性对照inhibitors(NC)+脂质体2000。以上转染试剂均购自吉玛公司。转染流程如下：胰酶消化细胞并接种至6孔板，培养至细胞融合达到60%～80%时,弃去培养液，将150 pmol inhibitors和5μl 脂质体2000加入250μl的无血清DMEM培养液分别进行稀释,充分混匀后室温静置5 min。将两种稀释液混匀，室温静置20 min后加入6孔板。经过6 h培养后，更换完全培养基继续培养待用。⑤Transwell侵袭实验：以不含血清的DMEM培养基按1∶5稀释Matrigel 胶，均匀包被于Transwell小室膜上，室温凝胶后吸出上清，将小室置入含200μl完全培养基的96孔板中。将siRNA转染后的细胞进行消化、洗涤并离心后，无血清培养液重悬，调整细胞浓度为1×105/ml,吸取200μl细胞悬液加入上室。常规培养24 h后，PBS淋洗小室，棉签轻柔擦拭膜内层细胞,无水酒精固定5 min后,结晶紫染色30min。将Transwell小室倒置于显微镜下,在200倍镜下随机选取5个视野,计数穿孔细胞。

结果

1肝脏细胞系和肝癌细胞系中BTC的表达情况见图1。RT-PCR检测人肝脏细胞系HL-7702和肝癌细胞系Huh7、HepG2、SMCC7721和MHCC97-H中BTC的mRNA表达情况，四种肝癌细胞系中BTC的mRNA表达量均高于肝脏细胞系(P<0.05),并且在侵袭能力更高的SMCC7721和MHCC97-H细胞系中BTC的表达量更高。Western blot检测BTC蛋白表达也得到一致结果。选择BTC高表达的SMCC7721和MHCC97-H进行下一步siRNA转染。

RT-PCR(A)和Western blot(B)示BTC在肝脏细胞系HL-7702和肝癌细胞系Huh7、HepG2、SMMC7721和MHCC97-H中的表达(*P<0.05,***P<0.001)

图1肝脏细胞系和肝癌细胞系中BTC的表达情况

2转染siRNA后SMCC7721和MHCC97-H细胞中BTC的表达变化见图2。与对照组相比，实验组的两种细胞BTC mRNA和蛋白含量均显著下调(P<0.001)。PCR所示SMCC7721和MHCC97-H中Tg737的敲减率分别为61.73%和63.44%。

(***P<0.001)

图2 PCR(A)和Western blot(B)示转染siRNA下调Tg737的结果

3下调BTC对SMMC-7721和MHCC97-H细胞侵袭能力的影响见图3。通过Transewell侵袭实验检测发现， siRNA下调BTC的表达后，SMMC7721和MHCC97-H细胞的侵袭能力明显下降(P<0.01)。

(**P<0.01)

4下调BTC通过抑制AKT-XIAP通路降低SMMC7721和MHCC97-H的侵袭能力 见图4。检测转染siRNA后SMMC7721和MHCC97-H细胞中XIAP的mRNA和蛋白表达水平，发现XIAP的表达明显降低(P<0.05)。Western blot检测发现，与对照组相比，实验组SMMC7721和MHCC97-H中磷酸化的AKT蛋白减少，同时AKT蛋白的表达没有变化。

(*P<0.05)

讨论

人BTC基因定位于4号染色体长臂上,其cDNA 全长为1.3 kB,其开放读码框共编码178 个氨基酸形成BTC前体蛋白。成熟人BTC 为糖蛋白，由80 个氨基酸组成，分子量为18 kD。它首先由Song等[4]从小鼠胰腺β细胞瘤细胞中发现并成功克隆，在胰腺、肝脏、肾脏等组织中都有较高表达。作为促癌因子EGF家族的一员，BTC主要与EGF受体家族中的ERBB-1 ( EGFR) 、ERBB-4同源二聚体结合,与ERBB-1、2、3、4 相互形成的异二聚体也有较低的亲和性[5]。因此，BTC也被与肿瘤联系起来。在肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌组织中都检测到了BTC蛋白的高表达。我们课题组前期的研究中也发现BTC蛋白的高表达与肝癌的病例特征密切相关，提示BTC与肝癌的侵袭转移能力相关。

检测正常肝脏细胞系HL-7702和四种肝癌细胞系中BTC的mRNA和蛋白表达我们发现，BTC在肝癌细胞系中的表达明显高于正常肝脏细胞系,并且随着肝癌细胞系侵袭能力的增强呈现出表达升高的趋势，提示BTC的高表达与肝癌细胞的侵袭能力密切相关。因此,我们通过siRNA转染的方式在高表达BTC的SMMC7721和MHCC97-H细胞系中下调BTC的表达并检测侵袭能力发现,下调BTC明显抑制了肝癌细胞的侵袭能力,但是其中的分子机制尚不清楚。

作为EGF家族的一员，BTC与其配体的结合可以激活细胞内的PI3K/AKT通路[6]。对PI3 K/AKT信号转导通路的研究表明，PI3K/AKT信号转导通路的激活可以通过促进金属蛋白酶的分泌[7],提高肿瘤细胞的侵袭能力，还可以促进细胞内X 染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达[8]。作为凋亡抑制蛋白(IAP)家族的一员,XIAP可以增强肝癌细胞的侵袭能力，而且XIAP在肝癌组织中的高表达与肝癌的转移能力密切相关[9]。那么，BTC与其配体的结合是否可以通过PI3K/AKT通路来促进XIAP的表达并进而促进肝癌细胞的侵袭能力呢？通过检测siRNA下调BTC后SMCC7721和MHCC97-H细胞中AKT、p-AKT和XIAP的表达我们发现，下调BTC可以抑制AKT的磷酸化并降低XIAP的表达，说明下调BTC可能是通过抑制PI3K/AKT-XIAP通路来抑制肝癌细胞的侵袭能力。

至此,我们通过siRNA下调肝癌细胞系SMMC7721和MHCC97-H中BTC的方式,说明了BTC下调可以通过PI3K/AKT通路抑制XIAP的表达,进而抑制肝癌细胞的侵袭能力,揭示了BTC调控

肝癌侵袭能力的分子机制，也为BTC靶向治疗肝癌的开展找到了有力证据。

参考文献

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[3]李军,高远,张光亚,等.β细胞素在肝癌中的表达及其与肝癌侵袭能力的相关性研究[J].陕西医学杂志,2014,43(2):158-159.

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[5]Dahlhoff M, Wolf E,Schneider MR.The ABC of BTC: Structural properties and biological roles of betacellulin[J].Seminars in Cell & Developmental Biology,2014,28(2014):42-48.

[6]Shi L,Wang L,Wang B,etal.Regulatory mechanisms of betacellulin in CXCL8 production from lung cancer cells[J].J Transl Med,2014,6(12):70.

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[8]Wehrkamp CJ,Gutwein AR,Natarajan SK,etal.XIAP antagonist embelin inhibited proliferation of cholangiocarcinoma cells[J].PLoS One,2014,9(3):e90238.

[9]Wu WY,Kim H,Zhang CL,etal.Clinical significance of autophagic protein LC3 levels and its correlation with XIAP expression in hepatocellular carcinoma[J]. Med Oncol,2014,31(8)：108.

(收稿：2016-01-11)

Down-regulation of betacellulin expression inhibits invasion of hepatocellular carcinoma cell through repression of PI3K/AKT pathway Department of Hepatobiliary & Pancreas Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University

(Xi’an 710032) Li JunBai JuanDou Kefenget al

ABSTRACTObjective: To study the influence of betacellulin(BTC) down-regulation on invasion of hepatocellular carcinoma(HCC) cells and to explore its mechanism. Methods: After down-regulating the expression of BTC through siRNA transfection, the invasion ability of SMMC7721 and MHCC97-H cells were respectively measured by transwell invasion assay, and the PI3K/AKT-XIAP pathway that associated with the invasion of HCC were detected by RT-PCR and Western blot. Results: The invasion capacity of SMMC7721 and MHCC97-H cells were significantly inhibited through down-regulation of gene BTC, along with the PI3K/AKT-XIAP pathway. Conclusion: Down-regulation of BTC expression inhibits the invasion of SMMC7721 and MHCC97-H cells through the repression of PI3K/AKT-XIAP pathway.

KEY WORDSLiver neoplasmsCell proliferationBetacellulinTumor suppressor proteins

【中图分类号】R735.7

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.001

·论著·基础研究·

*国家自然科学基金重点项目(81030010)

陕西省社会发展公关计划项目[2009K12-02(9)]

△陕西省府谷县人民医院普外科

◇陕西省榆林市星元医院内二科

▲通讯作者