一株铁还原菌的分离及其碳源利用特性研究

童　磊,李湘凌,吴纪南,袁　峰,周涛发

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥　230009)



一株铁还原菌的分离及其碳源利用特性研究

童磊,李湘凌,吴纪南,袁峰,周涛发

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥230009)

摘要:文章探究从污水处理厂污泥中筛选的一株铁还原菌的生长特性,研究不同碳源对Fe(Ⅲ)还原的影响。结果表明:此株铁还原菌株适宜的生长条件为pH=7、温度为35℃、黑暗条件;碳源类型和浓度显著影响菌株的铁还原能力,其最适碳源浓度为1.5 mol/L,以蔗糖、葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠、乳酸钠为碳源时,其Fe(Ⅲ)还原率依次降低,以蔗糖和葡萄糖为碳源时Fe(Ⅲ)还原率分别为81.0%和57.2%;Fe(Ⅲ)还原过程中脱氢酶活性与Fe(Ⅲ)还原率显著正相关,脱氢酶活性能在一定程度上反映Fe(Ⅲ)还原程度。

关键词:铁还原菌;碳源;脱氢酶活性

异化铁还原是铁还原菌介导进行的Fe(Ⅲ)还原,该过程广泛地存在于自然界的厌氧环境[1]。在异化铁还原过程中铁还原菌不仅以简单有机物等为电子供体,而且可以偶联难降解有机污染物氧化分解及重金属还原等,因而铁异化还原对环境污染修复具有重要的意义[2-3]。在异化铁还原相关研究中,高效铁还原菌的分离纯化工作是研究异化铁还原过程的基础,也是利用铁还原菌开展污染修复的基础。迄今,研究人员从各种厌氧环境中分离得到了不同的异化Fe(Ⅲ)还原菌,这些Fe(Ⅲ)还原菌可利用的电子供体包括了纤维素、糖类、氨基酸、氢气和有机酸等[3],如其中研究最为广泛和系统的Geobacter和Shewanella分别以乙酸盐和乳酸盐、丙酮酸盐为电子供体[4-5]。而微生物对碳源要求的单一性会极大地限制微生物在环境污染修复中应用。因此,研究并探明不同铁还原菌对不同碳源的利用特征,得到可利用多种碳源的铁还原菌对其在污染修复中应用具有重要意义。

本文从污水处理厂的污泥中分离纯化铁还原菌,以蔗糖、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠和乙酸钠分别作为碳源(电子供体),研究该铁还原菌厌氧条件下Fe(Ⅲ)的还原能力,并探索不同碳源条件下脱氢酶在Fe(Ⅲ)还原过程中的意义。

1材料与方法

1.1仪器

采用722E型分光光度计、无菌操作台、HC-2064高速离心机。

1.2培养基

50% LB液体培养基:蛋白胨5 g/L,酵母膏5 g/L,NaCl 2.5 g/L,调节培养基pH=7。

分离纯化培养基:C6H12O6·H2O 1.0 g/L,FeCl3·6H2O 9.6 g/L,NH4Cl 0.53 g/L,KH2PO40.272 g/L,CaCl20.056 g/L,NaHCO30.252 g/L(使用量根据富集期间pH=7±0.2而定),微量元素溶液1 mL。

铁还原培养基:柠檬酸铁3.3 g/L,NH4Cl 1 g/L,CaCl2·2H2O 0.07 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,K2HPO4·3H2O 0.722 g/L,KH2PO40.25 g/L,葡萄糖10 g/L,调节培养基pH=7。将该培养基在0.1 MPa下灭菌30 min,加琼脂粉10 g/L即为固体培养基。

1.3菌种来源及培养

菌种来源于合肥市王小郢污水处理厂的消化池污泥。

富集培养:将20 mL污泥和180 mL分离纯化培养基加入250 mL盐水瓶,氮气驱氧10 min后密封,30℃恒温暗条件下培养。待溶液颜色由棕黄色变成无色时,取盐水瓶中菌悬液继续富集培养。连续富集培养3次后,从盐水瓶中吸取2 mL富集培养液加入25 mL血清瓶中,同时添加18 mL柠檬酸铁培养基,氮气驱氧10 min后密封,于30℃恒温培养箱中培养,每隔一天摇匀,当菌液由黄色变成无色后,再连续富集3次。

分离纯化:取上述最终富集所得菌液在柠檬酸铁固体培养基上进行平板画线和涂布,待平板中长出细菌后,挑取形态一致、生长快的菌落接种到液体培养基中培养;将培养所得菌液划线和涂布,进一步分离纯化菌种;重复该工作5次后,根据菌落形态和细胞的一致性判断菌株的纯化状态,选取最优菌株。制得菌液,转入1.5mL离心管中,4 000 r/min离心10 min,弃上清液,分离得到的菌液于4℃保存备用。

1.4实验设计

1.4.1菌株基本理化性质分析

观察菌株在柠檬酸铁固体培养基上的菌落特征,并进行菌株革兰氏染色试验[6]。

1.4.2菌株生长特性

(1)pH对菌株生长的影响。将50% LB液体培养基的pH值用0.1 mol/L 的NaOH和HCl调至4、5、6、7、8、9,每个梯度设置3个水平,灭菌后接入2 mL菌悬液,置于30℃培养箱中避光培养。然后分别在第2、4、6、8、10、12、16、20、26、32、40 h用注射器在锥形瓶中取出2 mL,置于5 mL离心管中测定菌液OD值。

(2)温度对菌株生长的影响。将配置好的培养基pH值调节为7，灭菌后接入2 mL菌悬液,置于温度分别为4、15、20、30、35、40℃的培养箱中避光培养,每种温度下设置3个水平。然后按上述(1)的操作测定OD值。

(3)光照对菌株生长的影响。将配置好的培养基pH调节为7。灭菌后接入2 mL菌悬液,置于温度为35℃的培养箱中,分别采取连续光照和避光暗处理,每种处理设置3个水平。然后按上述(1)的操作测定OD值。

1.4.3不同碳源条件下的Fe(Ⅲ)还原

将纯化菌液扩繁32 h后,测定菌液浓度后备用。选用碳源为蔗糖(Sue)、葡萄糖(Glu)、丙酮酸钠(Pyr)、乙酸钠(Ace)和乳酸钠(Lac),以单一变量的控制方式分别添加,见表1所列。

表1　碳源添加量　mol/L

注:第1组的碳浓度为3.0 mol/L,第2～4组依次减1/2。

采用厌氧混合培养。分别取2 mL碳源、2 mL NH4Cl(5 g/L)和2 mL的柠檬酸铁溶液(13 g/L)于10 mL的血清瓶中,高压灭菌后,接种液2 mL扩繁菌液,并用灭菌后的磷酸缓冲溶液调节pH=7±0.2,氮气驱氧5 min，用胶塞和铝盖密封[7]后置于35℃恒温箱中培养。每组实验中不添加碳源为平行样。

1.5分析方法

(1)菌悬液浓度。比浊法测定,由于细菌悬液的浓度与光密度(OD值)成正比,因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度,选用600 nm波长分光光度计,以同样培养基作为空白对照,并对培养液从0 h起依次进行测定,对浓度大的菌悬液用未接种的液体培养基适当稀释后测定,使其OD值在0.10～0.65以内。

(2)Fe(Ⅱ)测定。采用邻菲啰啉比色法,在培养的1个周期内每天于同一时刻进行采样,每次采样时取待测样品1瓶,摇匀,用注射器平行取样品液2.0 mL 置于含2 mL的1+3 HCl(HCl与H2O的体积比为1∶3)的50 mL比色皿中,重复3组,分别加入5 mL铁缓冲溶液与邻菲罗啉溶液2 mL,显色5～10 min,在510 μm处以水为参比测量吸光度。

(3)脱氢酶活性测定。脱氢酶活性(dehydrogenase activity,DHA)测定采用TTC分光光度法[8],将吸取的1 mL样品溶液置于含有2 mL Tris-HC缓冲液(pH值为8.4)、0.5 mL 3.6 g/L Na2SO3溶液和0.5 mL 20 g/L TTC溶液的离心管中,重复3组,置37℃恒温水浴中避光反应2 h后加入0.5 mL 甲醛终止酶反应。再加5 mL丙酮作为萃取剂[9],37℃200 r/min振荡萃取10 min,于3 500 r/min离心5 min,取上清液于492 nm下测定吸光度。通过标准曲线计算生成的TF含量,定义1 h产生1 mg/L为1个脱氢酶活力单位(U)[10]。

1.6动力学模型

本文采用Logistic方程描述微生物介导的异化Fe(Ⅲ)还原过程[11],Logistic方程为:

其中,t为培养时间;ct表示培养时间t时体系中Fe(Ⅱ)的浓度;a为体系中Fe(Ⅲ)还原的最大潜势,即Fe(Ⅱ)的最大累积量;b为模型参数;k为反应的速率常数,即 Fe(Ⅱ)的累积速率常数。Fe(Ⅲ)还原反应的最大反应速率Vmax=0.25ak;最大反应速率对应的时间tVmax=ln(b/k)。

数据处理采用Curve Expert1.4。

2实验结果和讨论

2.1菌株基本生长特性

通过富集及分离纯化等过程,获得一株具有良好Fe(Ⅲ)还原能力的菌株。该菌株在柠檬酸铁固体培养基上的菌落较小,呈圆形或散状生长,菌落颜色为浅黄色,参考文献[12]初步判别该菌为革兰氏阴性菌,短杆状,长2 μm、宽0.8 μm,如图1所示。

图1　菌株在柠檬酸铁固体培养基及显微镜下形态图

pH值、温度、培养时间及光照条件对菌株生长[13]的影响如图2所示。

图2　铁还原菌在不同条件下菌悬液的光密度值(OD600)变化

图2a显示,在30℃、暗培养条件下,pH值分别为4、5、6、7、8、9时,菌液浓度差异较大,菌液浓度在pH=7是菌株生长最佳条件,其次为pH=6和pH=8,pH=9和pH=5再次之,当培养体系pH<4时不能存活。此株铁还原菌耐酸碱性能力较强。

在pH=7、暗培养条件下,温度对菌株生长的影响如图2b所示。由图2b可见,30℃为菌株生长最适温度,其次为30℃,而当温度为20、15℃时,菌株生长速度显著下降,温度降至4℃时菌株停止生长。温度为40℃时,培养时间超过16 h后,随着培养时间的增加,菌浓度显著下降,菌株表现出较差的耐热性。

在pH=7、温度为35℃条件下,暗培养条件下的菌量比光照条件下量多,因此暗培养有利于菌株的生长。

因此,该株铁还原菌最佳的生长条件是pH=7、温度为35℃、暗培养。

从培养时间上来看,在pH=7、温度为35℃、暗培养条件下,菌株在LB培养基中停滞期比较短,培养12 h左右生长曲线就进入对数期,26 h后进入稳定生长期,到32 h时的生物量最大,故在后续的碳源利用特征试验中,采用扩繁32 h处于菌株稳定期的菌液进行铁还原实验。

2.2碳源对铁还原菌Fe(Ⅲ)还原能力的影响

2.2.1碳源浓度对Fe(Ⅲ)还原的影响

碳源浓度对Fe(Ⅲ)还原的影响如图3所示(图注数值的单位为mol/L)。

图3中碳浓度为1.5 mol/L时分别对应蔗糖、葡萄糖、乙酸钠、乳酸钠和丙酮酸钠浓度为0.125、0.25、0.75、0.5、0.5 mol/L,以此类推。结果表明,未添加碳源时,培养体系中几乎未检测到Fe(Ⅱ),说明微生物Fe(Ⅲ)还原过程需要有电子供体才能进行。添加不同碳源时,反应体系中均可以检测到Fe(Ⅱ)的累积。当添加碳浓度为1.5 mol/L时,Fe(Ⅱ)的累积量明显大于0.75、0.375 mol/L碳浓度条件下的累积量。以蔗糖为例,碳浓度添加量为3.0、1.5、0.75、0.375 mol/L时,反应体系中Fe(Ⅱ)累积量分别为17.52、17.38、9.24、7.66 mg/L,1.5 mol/L碳浓度条件下Fe(Ⅱ)累积量分别是0.75、0.375 mol/L碳源浓度时Fe(Ⅱ)累积量的1.9和2.3倍,而3.0 mol/L的碳源浓度下Fe(Ⅱ)累积量并无显著的增加。由此可见,较低的碳源浓度因不能提供足够的电子供体,不利于Fe(Ⅲ)还原过程进行;过高的碳源浓度也未显著增加Fe(Ⅱ)的累积量,多余的碳源不能有效被菌株利用。因此,选择1.5 mol/L的碳源浓度是异化铁还原高效碳源浓度。

图3　铁还原菌利用不同碳源作为电子供体的Fe(Ⅱ)质量浓度变化

2.2.2碳源类型对Fe(Ⅲ)还原的影响

在添加不同碳源条件下,反应体系中Fe(Ⅱ)的积累量存在明显的差异,以蔗糖为碳源的体系中Fe(Ⅱ)累积量最多,其后依次为葡萄糖、丙酮酸钠、乙乳酸钠和乳酸钠。在1.5 mol/L最佳碳浓度条件下,蔗糖、葡萄糖、丙酮酸钠、乙乳酸钠和乳酸钠为碳源时,体系中Fe(Ⅲ)还原的比例依次为81.0%、57.2%、42%、30.8%、18.3%。可见该菌以蔗糖为碳源时的Fe(Ⅲ)还原能力最强,而以蔗糖无氧分解终产物乳酸钠为碳源时的Fe(Ⅲ)还原能力最弱。与文献[14]分离得到的一株铁/硝酸盐还原菌38.9%的Fe(Ⅲ)还原率(碳源为葡萄糖)相比,该菌表现出较强的Fe(Ⅲ)还原,而与文献[15]以葡萄糖为碳源的6株菌24.52%～92.11%的Fe(Ⅲ)还原能力相比,仍具有较好的Fe(Ⅲ)还原能力。

不同碳源条件下,随着时间的变化,体系中Fe(Ⅲ)还原变化趋势有较明显的差异。以葡萄糖和蔗糖作为碳源时,前7 d,体系中Fe(Ⅱ)迅速累积,之后体系中Fe(Ⅱ)累积量缓慢增加,到第9天时趋于稳定。以丙酮酸钠为碳源时,体系中的Fe(Ⅱ)累积量迅速增加,在第3天时Fe(Ⅱ)累积量已经达到最大累积量(以第11天计)的85.2%,表明铁还原菌以丙酮酸钠为碳源时能在较短时间内达到较高的Fe(Ⅲ)还原水平。乙酸钠和乳酸钠为碳源时,体系存在1～2 d的缓冲期,此时体系中Fe(Ⅱ)累积水平低,之后Fe(Ⅱ)累计量迅速增加,乳酸钠碳源体系中在第6天时Fe(Ⅱ)累积量已经达到最大累积量的82.3%,之后增幅降低,直到第10天左右Fe(Ⅱ)累计量趋于稳定。综上可见,从Fe(Ⅲ)还原率角度来看,蔗糖、葡萄糖是最佳碳源;从还原所需时间角度来看,丙酮酸钠是较好的碳源选择。

2.3Fe(Ⅲ)还原动力学

采用Logistic方程拟合不同碳源对Fe(Ⅲ)还原的影响,结果见表2所列。

表2　不同碳浓度下铁还原菌介导的Fe(Ⅲ)还原的动力学拟合

结果表明,丙酮酸钠为碳源时,乙酸钠浓度为1.5、0.375 mol/L时,不能用Logistic方程进行Fe(Ⅲ)还原动力学拟合,其他不同碳源条件下均能用Logistic方程拟合Fe(Ⅲ)还原动力学过程。从还原最大潜势a看,蔗糖和葡萄糖作为电子供体时Fe(Ⅲ)还原的最大潜势a随着碳源浓度增大而增大,而以乳酸钠和乙酸钠为电子供体时Fe(Ⅲ)还原的最大潜势与碳源浓度无明显的关联。从反应速率常数k看,Fe(Ⅱ)累积速率常数随添加的碳源浓度的降低而增加。高浓度的蔗糖(0.25、0.125 mol/L)和高浓度葡萄糖(0.5、0.25 mol/L)的最大反应速率Vmax比同系低浓度的蔗糖(0.062 5、0.031 25 mol/L)和葡萄糖(0.125、0.062 5 mol/L)的最大反应速率Vmax高出1倍,而高、低浓度乳酸钠和乙酸钠体系中最大反应速率无明显差别。最大反应速率对应时间(tVmax)均在第3～6天,表明铁还原菌要经过2～3 d生长期后大量增殖,参与Fe(Ⅲ)还原。Fe(Ⅲ)还原率均是高浓度比低浓度的高,其中蔗糖和葡萄糖随着浓度的加倍,还原率有较大的变化,而乳酸钠和乙酸钠的还原率很接近,与浓度的大小没有关系。这表明蔗糖和葡萄糖对此株铁还原菌有更大的还原潜势。

2.4不同碳源的脱氢酶活性变化

碳浓度为1.5 mol/L时,研究不同碳源条件下脱氢酶活性,结果如图4所示。

图4　铁还原菌利用不同碳源(c=1.5 mol/L)作为电子供体的脱氢酶活性变化

由图4可知随着培养时间增加,各碳源体系中脱氢酶活性增加,然而增长的幅度和时间有很大不同。前3 d中,不同碳源体系中脱氢酶活性差异较小,第4天开始,不同碳源条件下的脱氢酶活性差异显著,到第11天时,丙酮酸钠、蔗糖、葡萄糖、乙酸钠和乳酸钠条件下的脱氢酶活性依次为120.41、90.23、67.75、47.20、20.47 mg/(L·h),丙酮酸钠体系中的脱氢酶活性为乳酸钠体系中的脱氢酶活性的6倍。

每种碳源体系中的脱氢酶活性与Fe(Ⅱ)浓度的关系,见表3所列。由表3可知,蔗糖、葡萄糖、乙酸钠和乳酸钠碳源体系中Fe(Ⅱ)积累量与脱氢酶活性均为显著正相关关系,而丙酮酸钠碳源体系中Fe(Ⅱ)积累量与脱氢酶活性的相关系数明显低于其他4种碳源体系,但两者间仍为正相关。

表3　Fe(Ⅱ)浓度(y)与脱氢酶活性(x)的相关性

注:当α=0.05,r0.05=0.602 1;当α=0.01,r0.01=0.734 8;当α=0.001,r0.001=0.847 1。

对比不同碳源间的脱氢酶活性与Fe(Ⅱ)浓度可以发现,虽然丙酮酸钠碳源体系中脱氢酶活性显著大于其余碳源体系,但其Fe(Ⅱ)浓度小于蔗糖和葡萄糖碳源体系。这可能是由于蔗糖、葡萄糖在无氧条件下酵解为丙酮酸,提供给铁还原菌更多的能量,而丙酮酸还原生成乳酸的过程产能低,提供给铁还原菌可利用的能量低,从而导致丙酮酸钠碳源体系中虽然有高的脱氢酶活性,但体系中Fe(Ⅱ)积累较少。因此,脱氢酶活性可以在某种程度上反映碳源的利用程度,也能间接反映异化铁还原程度[16]。

综合不同碳源条件下的脱氢酶活性及Fe(Ⅱ)累积浓度分析,该菌具有利用多种碳源为电子供体异化还原Fe(Ⅲ)的能力,在环境污染物控制方面具有较好的应用前景,在污水处理中具有较好的应用前景。

3结论

(1)分离获得的铁还原菌可耐受pH值为5～9的酸碱度变化,其最佳生长条件为pH=7、温度为35℃、黑暗条件。

(2)在不同碳源条件下,异化铁还原最佳碳浓度均为1.5mol/L。蔗糖和葡萄糖是该菌株的最佳碳源,其后依次是丙酮酸钠、乙酸钠和乳酸钠。蔗糖和葡萄糖为碳源时,Fe(Ⅲ)还原率分别为81.0%和57.2%。

(3)碳源明显影响着异化铁还原过程中的脱氢酶活性,各碳源体系脱氢酶活性依次为丙酮酸钠>蔗糖>葡萄糖>乙酸钠>乳酸钠。碳源体系中,除去丙酮酸钠,脱氢酶活性与Fe(Ⅱ)累积量呈显著正相关,脱氢酶活性在某种程度上能反应异化铁还原程度。

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(责任编辑张淑艳)

Isolation of an iron-reducing bacteria strain and its carbon source utilization

TONG Lei,LI Xiang-ling,WU Ji-nan,YUAN Feng,ZHOU Tao-fa

(School of Resources and Environmental Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:An iron-reducing bacteria strain was isolated from municipal sewage sludge.The characteristics of the bacteria strain and the influence of carbon sources on the Fe(Ⅲ)reduction were studied.The results showed that the strain grew best when pH value was 7 and the temperature was 35℃ under the darkness condition.The iron reduction ability of the bacteria strain was significantly influenced by the type and the concentration of carbon source.The optimum concentration of the carbon source was 1.5 mol/L.When sucrose,glucose,sodium pyruvate,sodium acetate,sodium lactate were serviced as carbon sources respectively,Fe(Ⅲ)reduction rate of the strain reduced in turn.When sucrose and glucose were used as carbon sources,Fe(Ⅲ)reduction rate of the strain was 81.0% and 57.2% respectively.There was a significant positive correlation between the dehydrogenase activity of the strain and Fe(Ⅲ)reduction rate.Dehydrogenase activity could reflect the Fe(Ⅲ)reduction degree.

Key words:iron-reducing bacteria;carbon source;dehydrogenase activity

收稿日期：2015-01-04；修回日期：2015-03-04

基金项目：环保部公益性行业科研专项经费资助项目(201009041-03)

作者简介：童磊(1988-),男,安徽芜湖人,合肥工业大学硕士生;周涛发(1964-),男,安徽庐江人,博士,合肥工业大学教授,博士生导师.

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.04.021

中图分类号:X172

文献标识码：A

文章编号：1003-5060(2016)04-0536-07

袁峰(1971-),男,广西桂林人,博士,合肥工业大学教授,博士生导师;