神经生长因子修饰的间充质干细胞促进兔下颌骨牵张成骨时下牙槽神经损伤修复的实验研究

赵英华，刘晓昌，高　乐，陈李彤，杨子桧，王　磊

710004 陕西，西安交通大学口腔医院修复科(赵英华)； 710032 陕西 西安，第四军医大学口腔医院口腔颌面外科(刘晓昌，高乐，陈李彤，杨子桧，王磊)



·短篇论著·

神经生长因子修饰的间充质干细胞促进兔下颌骨牵张成骨时下牙槽神经损伤修复的实验研究

赵英华，刘晓昌，高乐，陈李彤，杨子桧，王磊

710004 陕西，西安交通大学口腔医院修复科(赵英华)； 710032 陕西 西安，第四军医大学口腔医院口腔颌面外科(刘晓昌，高乐，陈李彤，杨子桧，王磊)

【摘要】目的探讨慢病毒介导的人神经生长因子β(hNGFβ)在兔下颌骨牵张成骨模型中促进下牙槽神经损伤修复的作用。方法分离兔下颌骨中的骨髓间充质干细胞(MSC)并通过重组的慢病毒将hNGFβ基因插入到其基因序列中。对20只新西兰白兔进行下颌骨牵张成骨，并在手术时向骨牵张缝隙下牙槽神经周围植入经hNGFβ基因重组质粒转染的MSC或对照MSC(每组10只)。经过牵张，在固定期第14天处死动物并获取下牙槽神经样本进行神经组织学分析和神经组织形态定量分析。结果下牙槽神经组织分析显示，移植hNGFβ基因修饰MSC组与对照组相比较，有更多的再生神经纤维和更少的神经变性。神经组织形态定量分析显示，与对照组相比，移植hNGFβ基因修饰MSC组的有髓纤维密度显著增多，提示移植hNGFβ基因修饰MSC能够显著地加快兔下颌骨牵张成骨过程中的下牙槽神经的修复。结论慢病毒介导hNGFβ基因修饰MSC将有希望为临床减少牵张成骨造成的下牙槽神经损伤提供一种有效的基因治疗方法。

【关键词】神经损伤； 神经生长因子； 基因； 下颌骨； 牙槽； 兔

牵张成骨通过切开骨骼，逐渐在切骨线两端牵张骨间隙，促进新骨形成，同时使骨骼周围的肌肉、神经、血管、皮肤同期延长，从而达到延长骨骼的目的[1]，现在已普遍应用于临床治疗上下颌骨各种类型的发育不全畸形和骨缺损畸形[2]。然而，临床观察常有患者因下牙槽神经损伤导致感觉异常[3-4]。牵张成骨术中的下牙槽神经损伤原因包括外科手术的直接损伤和牵张力增加导致的间接损伤。大部分对下牙槽神经的直接损伤可以通过谨慎的外科手术规划和精细的手术技术避免，但是下牙槽神经在人为牵引力下的损伤需要很长的时间进行修复[5-8]。因此，需要外界干预来促进下牙槽神经的自我修复。

近年来发现的神经营养因子，使笔者对利用这些生长因子促进神经损伤修复产生了极大的兴趣[9-10]。如人类神经生长因子(human nerve growth factor beta，hNGFβ)对周围神经的损伤再生有很强的促进作用。笔者最近证明在兔下颌骨牵张成骨模型中在神经损伤部位局部注射hNGFβ可以明显地加速神经的组织学修复[11-13]。然而，局部注射肽类药物可能引起相应神经的二次医源性损伤,而且由于其受体分布广泛，在体内半衰期短，不能有效通过血脑屏障，在脑内很快降解，需要持续给药维持效果，使其在临床的应用受到明显限制。基因治疗是一种将编码表达产物的遗传物质定向转移到靶向器官或干细胞中的临床治疗手段[14-15]，慢病毒载体介导hNGFβ的表达已被证明是一种基于动物模型的基因治疗方式[16-22]。因此，可以通过生产一种更加稳定提供hNGFβ的经基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSC)来替代注射hNGFβ的方法修复神经损伤。在本次实验中，笔者目的是构建一种hNGFβ基因修饰的MSC维持体内分泌hNGFβ的正常生理水平，期望这种质粒转染的MSC可以有助于兔下颌骨牵张成骨中下牙槽神经损伤的修复。

材料与方法

1构建pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP质粒

设计上游带有酶切位点(NotI)、下游带有HindIII的引物，以酵母双杂交载体-人神经生长因子(pCL1-hNGFβ)为模版扩增hNGFβ片段。NotI+HindIII双酶切原始质粒中hNGFβ片段后， NotI+HindIII双酶切pDC316-mCMV-EGFP，回收线性化片段。将以上两步产物连接转化，聚合酶链式反应(PCR)鉴定、酶切鉴定，构建成pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP质粒。

2兔下颌骨MSC的分离和培养

首先处死兔并分离出下颌骨，将其切割成为细碎的组织块，然后加入3mg/mL胶原酶Ⅰ和4mg/mL分散酶Ⅱ 37 ℃水浴80min。使用细胞滤网(70μm) 进行过滤得到单细胞悬液，然后离心5min(500g)。将细胞接种于含有DMEM10%胎牛血清(FBS),抗生素(100U/mL链霉素，100U/mL青霉素)的混合培养液中以2×106100mm/皿的密度接种于培养皿中，于37℃ 5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，3d后弃上清液，更换新的培养液。当观察到贴壁细胞生长接近融合时进行传代培养，将经过二次传代培养的细胞用于接下来的实验。

3慢病毒载体转染MSC

将第二次传代培养后的兔下颌骨MSC在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24h后,将pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP和pDC316-mCMV-EGFP质粒加入到不同培养基中进行感染，感染复数为1000,100,10的比例。感染的过程需要进行2 000g 37℃1.5h的离心。将细胞用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗然后接种在新的培养基上，转染48h后对细胞进行光学和荧光显微观察。用0.25%的胰蛋白酶消化分离细胞，之后500g离心5min。转染后的MSC进行传代培养。

4转染后MSC的多向分化能力检测

取各组的第4代MSC常规消化后，接种于35mm培养皿。待细胞达到80%左右融合时，分别更换成骨诱导完全培养基(含B-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松等)及成脂诱导完全培养基，同时设立阴性对照组(未加诱导液的完全培养基)，每3d换液1次，诱导2周。4%多聚甲醛固定后分别行茜素红或油红染色，以显示成骨或成脂能力。

5转染后MSC hNGFβ表达的检测

取转染复数(MOI)=100慢病毒转染后3、5、7d的上清液进行hNGFβ的酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，hNGFβ ELISA试剂盒的使用参照制造商的操作说明书。

6动物实验和手术

本动物实验协议经由第四军医大学动物科研和教学应用委员会批准。本次试验共使用20只发育成熟的2.7～3.4kg雄性新西兰白兔。动物模型细节在相关文献中介绍[12-13]。对所有的实验兔麻醉、镇痛。使用特制的牵张器，小心实施手术操作，使固定器插入处远离下颌管2mm，以防对下牙槽神经的损伤。经过3.5d的延迟期后，以1mm/12h的速度逐渐牵张5d。将20只实验兔随机分为A、B两组，每组各10只，两组依次各自移植分别经上述两种质粒转染的MSC(5×106，0.1mL PBS)。两组移植均在手术过程中通过骨切开缝在右侧颌骨下牙槽神经周围实施，并且均在下颌骨左侧对称位置注射相同量(0.1mL)的PBS以作对照(图1)。

7神经的组织学分析和组织形态测定

14d后，处死所有兔，对组织进行固定。在牵张区域分离采集长度为9mm的下牙槽神经标本。所有的标本固定、酒精脱水后，以Epon包埋，制成1μm的切片，行甲苯胺蓝染色。每2mm的神经分别随机挑选3张切片标本在400倍光镜下观察。组织形态测定使用美国国家研究院的形态学分析系统，每个神经标本分别随机选取12个区域(每个切片4个区域)进行。所有测定均由专业的实验者盲法进行。最后计算有髓鞘神经纤维的密度(单位/mm)。

8统计学分析

结果

1重组pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP转染MSC后hNGFβ的表达

从兔下颌骨中分离出的骨髓MSC在相差显微镜下表现典型的梭形成纤维细胞样形态并且贴附在培养皿表面生长(图2a)。MOI 100(n=3)慢病毒感染后的MSC用荧光显微镜观察显示高表达的绿色荧光蛋白(图2b)。绿色荧光蛋白表达在转染MSC后的第15天仍然可以观察到。对转染后的MSC进行ELISA检测证明转染后MSC分泌的hNGFβ在转染3d后达到10ng/mL水平，并在转染后第5天和第7天上升到25ng/mL。在此ELISA检测结果的基础上之后所有的试验均选择使用MOI=100(n=3)慢病毒感染。

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图2从兔下颌骨中分离出的骨髓MSC培养后及其经pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP质粒转染后荧光蛋白的表达。a.从兔下颌骨中分离出的骨髓MSC在相差显微镜下表现典型的梭形成纤维细胞样形态并且贴附在培养皿表面生长;b.经慢病毒MOI=100转染后的MSC在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达

2转染后MSC的多向分化能力检测见图3。

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图3a.MSC成骨诱导后形成的钙结节经茜素红染色显示为红色(×100)；b.成脂诱导后油红染色示细胞内脂肪颗粒(×400)

3神经的组织学分析和组织形态测定

20只兔均可以耐受实验过程。神经组织学分析显示B组发生包括神经脱髓鞘、髓鞘裂解在内的神经退行性变化，且只有少量的神经纤维再生；相反，A组则可以观察到大量的再生神经纤维和少量的分解髓鞘残骸。神经组织形态定量显示A组的有髓鞘神经纤维密度明显高于B组(P<0.05,图4)。B组下颌骨左右两侧神经组织学和组织形态学定量显示没有明显差异。

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图4实验组和对照组兔下牙槽神经组织形态分析。a.甲苯胺蓝染色×400 荧光显微镜观察，图示比例尺为1μm;b.神经组织形态定量显示有髓鞘神经纤维密度(P<0.05)

讨论

下牙槽神经损伤在临床实践中是一个重要的问题，在许多不同的动物牵张成骨模型中都发现了神经组织学和功能的改变[5-8,22-23]。本组兔下颌骨牵张术中，下牙槽神经的病理学改变是因为骨牵张过程中的张力造成的。笔者尝试直接注射或提供可注射原料等维持 hNGFβ的方法来帮助下牙槽神经的修复[12-13]，但会产生对下牙槽神经的二次损伤，并且注射药物半衰期较短，只能保持1～3d的活性，而预实验发现神经损伤在2周内的修复是最关键的，体外注射维持 hNGFβ水平的方法还不能满足临床需求。基于此问题，在本次研究中笔者成功构建了hNGFβ基因修饰的质粒，并通过慢病毒介导转染骨髓MSC，通过这种方法使得MSC可以自行分泌hNGFβ；之后，笔者在牵张成骨过程中局部应用hNGFβ基因修饰的MSC以此加快了牵张术后造成的下牙槽神经损伤的修复，没有出现任何因注射造成的二次神经损伤。

腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体和慢病毒载体都是在动物神经疾病和损伤模型中用于介导神经营养因子基因表达的有效基因治疗方法[16-22]。慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。不仅如此，慢病毒经常与保持目的基因在宿主细胞内稳定的表达有肯定的关联[15-16，21]。

本实验中笔者发现慢病毒介导的MSC在第7天仍然能够使hNGFβ保持在生理水平，这说明hNGFβ基因已经成功地整合到MSC的DNA中。动物牵张成骨模型中，在越来越大牵张力的作用下在牵张末期神经表现出最严重的水肿和缺血。NGF在加快施万细胞的激活和增殖及指导神经轴突的修复和髓鞘再生方面发挥着至关重要的作用。所以在牵张期末期和固定期初始很可能是NGF水平不足，难以维护和再生神经的关键时间。因此，将慢病毒转染的MSC在手术中移植到体内可以在牵张期末期和固定期初期提供足够的外源性NGF，从而加速神经纤维的再生。此项研究的主要目标是研究牵拉应力拉伸作用对神经的轴性损伤，神经轴性损伤与直接离断等损伤在病理学方面有很大差别，而临床中的DO神经损伤大多都是轴性损伤；且人为损伤的神经和DO牵张力造成的神经损伤模式伤情不一致，恢复模式也不同，所以未将直接离断等损伤形式列为分组因素。

总之，本研究证明了在牵张器植入时移植经hNGFβ基因修饰的MSC能显著加快兔下颌骨牵张术后下牙槽神经的修复，经慢病毒介导的移植hNGFβ基因修饰的MSC基因治疗有望将牵张成骨造成的神经损伤和临床上其他神经损伤降到最低。

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(本文编辑： 黄利萍)

Nerve growth factor-modified mesenchymal stem cells in the acceleration of recovery of inferior alveolar nerve injury in rabbit mandibular distraction osteogenesis

ZHAOYing-hua1,LIUXiao-chang2,GAOLe2,CHENLi-tong2,YANGZi-hui2,WANGLei2

(1.Department of Prosthodontics,School of Stomatology,Xi’an Jiaotong University,Xi’an710004,China; 2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi’an710032,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of lentiviral-mediated human nerve growth factor beta (hNGFβ) on repair of inferior alveolar nerve (IAN) in mandibular distraction osteogenesis (DO) in rabbits. MethodsBone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) from rabbit mandibles were isolated and genetically engineered using recombinant lentiviral vector containing hNGFβ. Twenty New Zealand white rabbits underwent mandibular DO and transplantation of 5 million MSCs transduced with hNGFβ-vector or control vector around the IAN in the bone fracture gap during the surgery(n=10). After the distraction,IAN samples were collected for histological and quantitative analysis at the 14th day of consolidation period. ResultsIAN histology showed that the experiment group had more regenerating nerve fibers and less nerve degeneration than the control group. Quantitative analysis of nerve morphology showed that the density of myelinated nerve fibers increased significantly compared with the control group. This indicated that the MSCs transduced with hNGFβ could significantly promote IAN repair during mandiblar DO. ConclusionLentiviral-mediated transduction with hNGFβ in MSCs may provide an effective gene therapy for reduction of nerve injury in mandibular DO clinically.

【Key words】nerve injury; nerve growth factor; gene; mandibular bone; dental alveoli; rabbit

文章编号：1009-4237(2016)03-0168-04

基金资助：国家自然科学基金项目(81270015)

【中图分类号】R 651

【文献标识码】A【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.03.013

(收稿日期：2014-10-13； 修回日期： 2015-09-10)

共同第一作者： 刘晓昌