应用近红外光谱法定量检测牛奶中尿素氮的研究

刘永峰，李双红，库　婷，昝林森

(1 陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安710062；2 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)



应用近红外光谱法定量检测牛奶中尿素氮的研究

刘永峰1，李双红1，库婷1，昝林森2

(1 陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安710062；2 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]【目的】 建立牛奶中尿素氮的快速、无损检测方法，为牛奶中尿素氮的快速检测提供支持。【方法】 对200个牛奶样品进行近红外扫描，并用多功能乳制品分析仪对牛奶样品中尿素氮的含量进行测定；剔除20个异常样品后，得到由180个牛奶样品组成的得分样品，将得分样品分为定标集(144个)和验证集(36个)，将正交试验设计与主成分回归法(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、改进偏最小二乘法(MPLS)3种定量校正方法和多种光谱预处理方法结合，建立牛奶中尿素氮的近红外检测模型，利用目标函数法对模型预测效果进行评定。【结果】 建立了定量检测牛奶中尿素氮的最优模型，其定标相关系数(R2)和定标标准差(SEC)分别为0.986 4和0.238 4。用验证集对所建模型进行验证，其校正相关系数(RSQ)和预测标准差(SEP)分别为0.976 0和0.360 0。利用所有得分样品对预测结果进行监控，并绘制尿素氮测定值与模型预测值的线性相关曲线，相关系数r2为0.980 5。【结论】 利用近红外光谱法建立的尿素氮定量检测最优模型具有很好的适用性和准确性，可用于牛奶尿素氮的快速定量检测。

[关键词]牛奶品质；近红外光谱；尿素氮；快速检测

近年来，随着我国经济的迅猛发展，人均消费水平不断提高，人们对于食品的需求观念正逐渐由数量型向质量型转变。牛奶是接近全价的营养食品，深受消费者的青睐，其需求量不断增加，但是目前我国奶源短缺，奶源基地的薄弱使得牛奶质量难以保证，一些黑心奶农和不法商贩为使兑水牛奶的蛋白质含量达标而掺入尿素[1]。尿素本是机体蛋白质代谢的最终产物，存在于哺乳动物的乳汁中，正常含量在350 mg/L以内[2]，也有报道认为尿素氮在620 mg/L以内是正常的[3]。尿素作为一种非蛋白氮物质，少量存在不会影响牛奶品质，但超过正常含量范围就会对消费者的身体健康造成危害。有学者研究了尿素对小鼠体表心电图和心室肌细胞钠离子通道电流的影响，发现尿素可以通过抑制心室肌细胞钠电流使小鼠发生传导阻滞性心律失常[4]。另有报道指出，长期从事尿素作业的工人，其肺脏、免疫系统和细胞遗传方面均会受到不同程度的损害[5]。因此，十分有必要探究并建立一种快速、高效、定量分析牛奶中尿素氮含量的方法。

目前，国内主要采用化学分析法检测牛奶中的尿素氮含量，但检测过程繁杂、耗时长，需要配制大量的化学试剂，且会污染奶样。与化学分析法相比，近红外光谱法作为一种快速、无损、定量检测技术，可在短时间内获取大量样品信息，该技术已经在食品质量和营养指标检测中被逐渐应用[6]，而且一旦近红外光谱最优模型确立后就无需再配制化学试剂，这样就大大提高了检测速度。近红外光谱技术在国外已被应用于牛奶中尿素氮的定性检测，并对其化学分析方法和近红外分析方法进行了比较[7]，但是尚未见将其用于牛奶中尿素氮定量分析的报道。国内利用近红外光谱法检测牛奶中尿素氮的研究尚较少，主要是因为仪器昂贵、检测方法还不成熟，尤其是牛奶中尿素氮的含量较少、检测难度较大。马小红等[8]利用近红外光谱技术对牛奶中抗生素的含量进行了测定，黄富荣等[9]利用近红外光谱法测量了全血中胆固醇和甘油三酯的含量，其灵敏度均较高。为此，本研究利用近红外光谱法建立了牛奶中尿素氮的快速、无损检测方法，并筛选了牛奶中尿素氮最优近红外检测模型，旨在为牛奶中尿素氮的快速检测提供支持。

1材料与方法

1.1材料和仪器

1.1.1材料牛奶样品于2013年12月采自西安综合开发总公司畜牧开发公司奶牛场200头健康的中国荷斯坦奶牛，所有样品均用离心管采集，将采集管编号后保存，每管采集样品量约为15 mL，放入冰盒带回实验室。

1.1.2仪器MilkoScan FT120型多功能乳制品分析仪和Infraxact型多功能近红外光谱分析仪，均购自瑞典FOSS公司。

1.2试验方法

1.2.1牛奶样品光谱的采集利用多功能近红外光谱分析仪扫描样品光谱。仪器配置检测器：硅(570～1 100 nm)，铟镓砷(1 100～1 850 nm)；波长范围：570～1 850 nm；操作温度：0～40 ℃，扫描速度：1.8次/s，采样间隔2 nm；每个样本重复扫描3次，取平均值。采用化学计量软件WinISI Ⅲ对样品进行定标和模型的验证。

1.2.2牛奶样品尿素氮的测定采集完用于近红外光谱分析的牛奶样品，立即采用多功能乳制品分析仪测定其中尿素氮的实际含量，并按样品编号记录数据。

1.2.3实际测定数据的输入得到牛奶的扫描光谱图和牛奶中尿素氮含量的实际测定值后，将实际测定值通过WinISI Ⅲ软件平台输入到对应样品的光谱文件中，生成对应指标的原始样品光谱集。

1.2.4异常样品的剔除原始样品光谱集中包含大量样品信息，其中由于试验条件的改变、样品性质的变化以及仪器的测量误差和人为测量误差得到的数据被视为异常样品，这些样品的存在往往会严重影响模型的准确性[10]，在建模前必须要将其除去。利用WinISI Ⅲ软件对光谱文件进行聚类分析，采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)法，即利用文件中的扫描数据计算得分，以此统计文件中各样品间的差异，马氏距离超过3.0的样品也被视为异常样品[11]，均被剔除。将剔除异常后的样品作为得分样品，并按“隔四选一”的方法将得分样品分为定标集和验证集。

1.2.5定标模型的建立(1)光谱数据处理方法的选择。 在采集样品光谱时，为避免仪器的状态及测量环境中的温度、湿度和噪声等因素影响样品光谱的扫描，本研究对光谱数据进行一定的处理，旨在提高其信噪比，改善分析信号的质量，消除随机误差的影响，保证模型的稳健性和有效性。经研究比较及分析，本研究确定采用的光谱预处理参数设置包括：散射校正(无散射处理(N)、标准正常化结合趋势变化法散射处理(SNV+D)、多元散射校正(MSC))；导数处理(0阶导数、1阶导数、2阶导数)；导数处理间隔点数(1个、4个、8个)；平滑处理间隔点数(1个、4个、8个)；二次平滑处理间隔点数(1个、4个、8个)。

(2)定量校正方法的选择。 采用WinISI Ⅲ软件给出的3种定量校正方法，即主成分回归法(Principal component regression,PCR)、偏最小二乘法(Partial least squares regression,PLS)、改进偏最小二乘法(Improved partial least squares regression,MPLS)进行校正。

(3)正交试验设计。 综合以上因素可得到6种不同的设置和3个不同的水平，如果按各个因素水平的所有可能搭配进行试验，需要进行36=729次运算，工作量非常大。所以，本研究采用试验优化设计的思路[12]，将6种不同的设置作为试验因素，每个因素设定3个水平，进行正交试验，具体设计见表1。通过正交试验设计，试验只需进行27次分析即可得到结果。

(4)最优模型的确定。 经试验得到27个定标模型后，为了筛选相关系数高、预测性能好的模型，本研究采用目标函数法评价所建模型的优劣，进而确定最优模型[13]，即：f(x)=R/(1+SECV)。其中，f(x)为定标分析模型的目标函数值，R和SECV分别表示定标相关系数和交叉验证标准差，均由软件计算得出。

1.2.6最优模型验证本研究利用未参与定标的样品集(即验证集)对已确定的检测牛奶中尿素氮含量的最优模型进行检验，并将偏差(Bias)、预测标准偏差(SEP)、校正相关系数(RSQ)作为模型预测性能好坏的评价指标。

2结果与分析

2.1牛奶中尿素氮含量的数据分布

本试验采集牛奶样品共200个，剔除异常样品20个，剩余得分样品180个，对得分样品进行分集，结果如表2所示。由表2可见，定标集牛奶样品尿素氮含量为120～203 mg/L，验证集样品尿素氮含量为129～203 mg/L，定标集样品尿素氮含量范围覆盖了验证集样品，通过WinISI Ⅲ软件分析得到定标集样品和验证集样品中尿素氮含量的分布如图1、2所示。

表 2　牛奶样品中尿素氮含量的分集分析

由图1、2可以看出，定标集样品的尿素氮含量在120～203 mg/L内均有分布，验证集样品的尿素氮含量在129～203 mg/L内均有分布，说明两类样品分布均匀、合理，具有很好的代表性，可以达到建立近红外光谱分析模型的要求[14]。

图 1　待测牛奶样品定标集尿素氮含量的分布

图 2　待测牛奶样品验证集尿素氮含量的分布

2.2牛奶中尿素氮含量检测的定标结果与分析评价

利用定标集并结合正交试验设计共建立了27个定标模型，试验结果见表3。结合表3数据，通过比较目标函数值的大小[15]，确定了影响建模的最佳因素组合为A3B2C2D3E3F3，即定量校正方法为MPLS，光谱预处理时采用的散射校正方法为SNV+D，1阶导数处理，导数间隔点数为8个，平滑处理间隔点数为8个，二次平滑处理间隔点数也为8个。

通过目标函数初步确定了检测牛奶中尿素氮含量的最佳定标模型，但对于该模型的优劣程度还需要利用其他指标做进一步评价，WinISI Ⅲ软件给出了评价定标模型好坏的相关指标：定标决定系数(R2)用于考察预测值与实际值的接近程度；定标标准差(SEC)用于评价所采集数据用以建立模型的可信度[16]；交叉验证标准差(SECV)用于评价所建模型对内部样本的预测能力；定标建模过程中，进行交叉验证计算时所得的相关系数(1-VR)，用于反映样品集尿素氮含量变化贡献的百分率。一般，R2值和1-VR值越大，SEC和SECV值越小，说明近红外测定值与化学分析值越吻合，模型的可信度越高，所建模型就越好[17-19]。本研究利用目标函数法确定的模型R2值为0.986 4，1-VR值为0.975 4，均接近于1；而SEC值为0.238 4，SECV值为0.321 9，数值均较小。表明所建模型的近红外预测值与实际测定值之间拟合度较好，为最优模型。

表 3　牛奶中尿素氮含量最佳定标模型的正交试验结果

注：f(x)代表牛奶样品中尿素氮含量的目标函数值；Rk代表每个因素下3个水平的极差，用于衡量各因素对目标函数的影响程度，即Rk越大，其对目标函数影响越大；ki代表同一因素下相同水平目标函数的平均值(i=1,2,3)。

Note:f(x) value is the objective function value of milk urea nitrogen content；Rk(range for three levels of each factor) is used to assess the impact of each factor on the objective function value;kiis average value of the objective function at same levels of each factor(i=1,2,3).

2.3牛奶中尿素氮定量检测最优模型的适用性验证

确定牛奶中尿素氮定量检测最优模型后，利用验证集对最优模型进行检验，得到模型的Bias值为-0.01，接近于0；SEP值为0.360 0，表明牛奶中尿素氮含量的测定值与模型预测值差异较小；RSQ值达到0.976 0，说明测定值和模型预测值的相关性高，模型的预测能力很好。

利用WinISI Ⅲ软件中的结果监控操作，并用全部得分样品对模型预测结果进行监控，观察样品散点图(图3)可看出，除极少数样品点在报警线以外，其他样品点均分布在回归中线周围，表明样品中尿素氮含量的模型预测值与测定值之间相关趋势明显。以牛奶样品中尿素氮测定值为y，预测值为x，进一步对样品中尿素氮的模型预测值与测定值进行线性关系拟合，结果见图4。由图4可见，拟合的线性方程为y=0.991x+1.308 7，线性相关系数(r2)达到0.980 5，说明模型的预测性能较高，牛奶中尿素氮含量测定值与其模型预测值的相关性良好。

图 3　待测牛奶全部得分样品对最优模型预测尿素氮含量结果的监控情况

图 4　牛奶中尿素氮含量测定值与模型预测值的相关性

3讨论与结论

国内测定牛奶中尿素氮含量的方法有很多，宋丹等[20]、范志影等[21]采用对二甲氨基苯甲醛(PDAB)比色法检测牛奶中的尿素氮含量，这种方法对PDAB的用量控制要求严格，虽然测定结果稳定性好，但其灵敏度尚有待提高。翟少伟[22]研究了二乙酰-肟法检测牛奶中尿素氮含量的测定波长和水浴时间，表明测定波长为525 nm及水浴时间为13 min时测定结果较好，尽管此方法所用试剂易得，成本低，但在操作时需加热煮沸，所用试剂具有毒性和腐蚀性，易污染环境，所以这种测定方法只适用于在实验室规范操作下进行。魏峰等[23]探究了利用亚硝酸盐-格里斯试剂法检测牛奶中是否掺入尿素，其将待测样品与一定量的亚硝酸盐在酸性条件下反应一段时间后加入格里斯试剂，通过比对溶液颜色与标准溶液颜色来判断是否有尿素存在，但该方法也需高温和强酸处理，不适用于现场快速检测。杨仁杰等[24]采用中红外光谱技术检测牛奶中的尿素含量，相同测定条件下，根据牛奶中尿素吸收峰面积与其浓度之间的线性关系实现对牛奶中尿素的定量分析，该方法线性相关系数虽能达到0.96以上，但是准确度方面还有待于完善。本研究利用近红外光谱法检测牛奶中尿素氮含量，线性相关系数达到0.98以上，可见应用近红外光谱法可以弥补中红外光谱在准确度方面的欠缺。

本研究采用PCR、PLS和MPLS 3种定量校正方法成功建立了牛奶中尿素氮含量的近红外测定模型，并结合正交试验设计和目标函数法建立了检测牛奶中尿素氮含量的最优模型。利用未参与定标的验证集对最优模型进行检验，同时采用指标R2、SEC、SECV和1-VR值对模型的定标效果和预测精度进行评价，并通过监控软件对结果进行了监测验证。因此，本研究利用近红外光谱法结合模型优化设计建立的检测牛奶中尿素氮含量的模型，具有预测性能高、适用性较好的优点，可为相关检测部门应用近红外光谱技术快速检测牛奶中的尿素氮含量提供技术支持。

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Quantitative detection of milk urea nitrogen using near infrared spectroscopy

LIU Yong-feng1,LI Shuang-hong1,KU Ting1,ZAN Lin-sen2

(1CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China;2CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 A method that can quickly and non-destructively measure milk urea nitrogen was established to provide support for detection of urea nitrogen in milk.【Method】 A total of 200 milk samples were scanned by InfraXact NIR analyzer,and the contents of urea nitrogen were measured using the multifunctional analyzer of dairy.After eliminating 20 abnormal samples,the scored 180 milk samples were grouped to the calibration set (144 samples) and the validation set (36 samples).Then,the orthogonal design was combined with principle component regression (PCR),partial least square (PLS),modified PLS and multiple pretreatment methods to establish the model of milk urea nitrogen.The objective function method was used to evaluate the model.【Result】 The optimal model for quantitatively testing milk urea nitrogen was built with the calibration coefficient (R2) and standard error of calibration (SEC) of 0.986 4 and 0.238 4.The correlation coefficient (RSQ) and standard error of prediction (SEP) when using validation set to examine the model were 0.976 0 and 0.360 0.Finally,all scored samples were used to monitor the predicted results and the linear correlation curve between the measured and predicted values was drafted,which had the correlation coefficient r2 of 0.980 5.【Conclusion】 The optimal model for quantitatively testing milk urea nitrogen based on near infrared spectroscopy had good applicability and accuracy.

Key words:milk quality;near infrared spectroscopy;milk urea nitrogen;rapid detection

DOI：网络出版时间:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.027

[收稿日期]2014-09-05

[基金项目]陕西省青年科技新星项目(2014KJXX-51)；中国博士后科学基金项目(2015M570811)；中央高校基本科研业务费专项(GK201505126)；国家科技支撑计划项目(2012BAD12B07)

[作者简介]刘永峰(1981-)，男，陕西户县人，副教授，博士，主要从事畜产品科学与营养研究。E-mail:yongfeng200@126.com[通信作者]昝林森(1963-)，男，陕西扶风人，教授，博士，主要从事动物生物技术研究。E-mail:zanlinsen@163.com

[中图分类号]S859.84

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)04-0203-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.054.html