毛尖茶叶中脂氧合酶活性测定方法的建立

吴桂玲+吴艳玲+刘品祯

摘要：采用紫外分光光度法，以亚油酸钠为反应底物，研究毛尖茶叶中的脂氧合酶（LOX）的酶活性测定方法。结果表明，毛尖茶叶中的脂氧合酶的最适pH值为6.3，最适温度为50 ℃，在底物300 μL时酶活性最好，且有较好的热稳定性，60 ℃保温1 h后仍具有一定活性。

关键词：毛尖茶叶；脂氧合酶（LOX）；活性

中图分类号： S571.101

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0331-03

都匀毛尖别称“白毛尖”“细毛尖”“鱼钩茶”“雀舌茶”，是中国十大名茶之一，产于贵州省都匀市，都均市属贵州省黔南州布依族苗族自治区。都匀毛尖主要产于牛场、白芒、团山一带，这里山谷起伏，峡谷溪流，冬无严寒，夏无酷暑，四季怡人，年均气温16 ℃，年均降水量1 400 mm。加上土层深厚，泥土疏松湿润，土质是酸性或微酸性，内含大量铁质和磷酸盐，这些特殊的自然条件不仅适宜茶树的生长，而且也形成了都匀毛尖的独特风格，都匀毛尖因独特的芳香气味而备受青睐[1]。目前分离得到的与茶叶芳香气味有关的物质主要是一些小分子的醇、醛、脂类物质，在茶叶中这些小分子物质主要是由脂氧合酶、脂氢过氧化物裂解酶联合催化产生，其中脂氧合酶是关键酶[2]。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）别称脂肪氧化酶、脂氧酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶（LOX），是一种含非血红素铁的加氧酶，专一催化具有顺、顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其相应的脂，通过对其分子加氧，形成具有共轭双键的脂氢过氧化物（hydroperoxides，HPOD）[3]。在茶叶中HPOD进一步被脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）催化，从而生成各种挥发性的脂类物质，即茶叶芳香味的来源。因此，研究茶叶中脂氧合酶的活性，以及建立一个简便、准确、重现性好的LOX活性测定体系可为茶叶芳香气味形成生理的基础研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料茶树鲜叶采自贵州省都匀市白芒；亚油酸（Sigma 公司生产，纯度为99. 9%）；吐温20；麦氏缓冲溶液（pH值为6.3，0.1 mol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）。其他化学试剂均为分析纯，试验用水为实验室自制去离子水。

1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-2C精密pH计，上海理达仪器厂；HH-S型数显恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；GTR21-1 高速冷冻离心机，上海赵迪生物科技有限公司；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 反应底物的制备

参照Axelord等的方法[4]，略作修改后具体操作如下：将0.25 mL 吐温20分散于10 mL、pH值为9.0的0.2 mol/L硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入0.27 mL亚油酸，充分混合，再加入1 mol/L氢氧化钠溶液使体系澄清，并调pH值至90，然后用上述缓冲液稀释到500 mL作为底物。

1.4 粗酶液（LOX）的提取

将鲜茶叶洗净晾干，粉碎，称取10 g加入200 mL pH值为6.3的麦氏缓冲溶液，匀浆2 min，过滤，滤液在4 ℃时高速离心5 min，取上清液，加入固体硫酸铵至30%饱和度，放入冰箱4 h后取出，高速离心5 min后取上清液，加入固体硫酸铵至70%饱和度，在冰箱中过夜，取出高速离心10 min，取沉淀加入15 mL麦氏缓冲溶液溶解，得到粗酶液。

1.5 脂氧合酶（LOX）活性的测定

参照Axelrod等的方法[4]，略作修改后具体操作如下，取亚油酸钠母液50 μL，缓冲液2 750 μL，粗酶液0.2 mL，配成3 mL 反应体系。在室温25 ℃下反应，测定234 nm处的吸光度（D）。反应1 min时记录1个数据，反应5 min时再记录1个数据，观察2个时间D值的变化。重复3次。酶活性以ΔD234 nm/（g·min）来表示。酶活计算公式：

1.6 毛尖茶叶中LOX酶最适pH值的测定

在不同的pH值条件（pH值=6.0～7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值=7.5～8.0磷酸盐缓冲液，pH值=8.0～9.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，缓冲液的浓度均为0.1 mol/L）下，在3 mL反应体系中依次加入麦氏缓冲液2 750 μL、亚油酸钠母液50 μL、粗酶液0.2 mL，加入后立即准确计时，反应1 min时测1个吸光度值，待反应5 min后再测1个吸光度值，酶活性同样以ΔD234 nm/（g·min）来表示。重复3次，以LOX活性最大时的酶反应的pH值作为毛尖茶叶LOX的最适pH值。

1.7 毛尖茶叶中LOX酶最适温度的测定

将1支空试管置于不同温度（10、20、30、40、50、60、70、80 ℃）的恒温水浴中，于试管中依次加入麦氏缓冲液（pH值=6.3，0.1 mol/L）2 750 μL、亚油酸钠母液50 μL、粗酶液0.2 mL。加入后立即准确计时，反应1 min时测1个吸光度值，待反应5 min后再测1个吸光度值，酶活性以ΔD234 nm/（g·min）来表示。重复3次，以LOX活性最大时的酶反应温度作为毛尖茶叶LOX的最适温度。

1.8 毛尖茶叶LOX酶反应最适底物浓度的测定

在50 ℃、pH值为6.3时，在不同底物浓度下反应，测定LOX酶活性。测定体系基本同“1.5”节，在3 mL反应体系中分别加入底物亚油酸钠母液25、50、100、150、200、250、300、350、400 μL，通过调节所加缓冲溶液的体积来保证最终3 mL体系不变。

1.9 毛尖茶叶LOX酶的热稳定性研究

在pH值为6.3时，在不同温度（30～80 ℃）下处理LOX粗酶液3 min，测定其吸光度值，然后再用相应的温度处理1 h后，立即置于冰上，降至室温（15 ℃）下测定酶保持的活力，测定体系同“1.5”节。

2 结果与分析

2.1 毛尖茶叶LOX酶的最适pH值

由图1可见，毛尖茶叶LOX活性有2个活性峰，其中pH值=6.3时活性最高；另外在碱性范围（pH值=7.5附近）也有1个小峰，但很不明显，其LOX活性远低于pH值=6.3时的活性峰。类似茶叶脂氧合酶的这种情况在其他物种中也有。如侧耳（Pleurotus ostreatus）中的LOX在pH值=8.0处有最大活性，在pH值=4.5处也有1个较小的峰[5]；念珠地丝菌（Geotrichum candidum）中的LOX在pH值=3.75和pH值=8.0处显示了最大活性[6]；桃果实中的LOX在pH值=4.5和pH值=6.0处有最大活性[7]；尼罗罗非鱼（Tilapia nilotica）中鳃组织的LOX在pH值=10.0和4.0处也有最大活性[8]。对于植物中LOX活性最适pH值的研究也有报道，如甜玉米的最适pH值为6.0[9]；猕猴桃为5.0～5.5[7]；花生种子为5.8和8.0[10]；水稻为7.6[11]；荔枝果实为6.5[12]；番茄为6.0左右，黄瓜为7.0左右，甜瓜为 7.0，青苹果为65[13-14]。对于茶叶中LOX的最适pH值也有报道，如陈宗道等研究发现茶树中LOX的最适pH值为6.2[15]，而本研究的毛尖茶叶的最适pH值为6.3，与其相差不大。因此毛尖茶叶中LOX活性的最适pH值为6.3，在碱性范围（pH值=75）附近也有1个较小的活性峰。

2.2 毛尖茶叶LOX酶的最适温度

由图2可见，在10～20 ℃时LOX活性呈缓慢上升趋势，20～30 ℃时缓慢下降，在30～50 ℃时急剧上升，至50 ℃时达到最大值，50 ℃后开始急剧下降。有关其他物种LOX活性最适温度的报道有大豆LOX最适温度18 ℃[16]；花生种子脂氧合酶的最适反应温度为35 ℃[10]；黄瓜果实脂氧合酶的最适温度为40 ℃[13]；对于植物来源的香蕉叶片LOX最适温度为40 ℃[17]；水产动物罗非鱼鳃组织中脂氧合酶的最适温度为30 ℃[8]；而陈宗道等的研究结果表明茶树中LOX的最适温度为40 ℃[15]。而本研究的毛尖茶叶LOX最适温度为50 ℃。

2.3 毛尖茶叶LOX酶反应最适底物浓度的测定

由图3可见，在3 mL反应体系中加入300 μL底物亚油酸钠母液时测得的酶活性最大。在低浓度范围内，酶反应速度随底物体积增加而增加，当底物体积增加到一定值后，酶活性却下降，这可能是由于底物亚油酸与LOX反应过程中，也有一部分在空气中自动氧化为羟基过氧化物，而当生成的羟基过氧化物达到一定浓度时，就会引起LOX自我失活[6]。

2.4 毛尖茶叶LOX酶的热稳定性

由图4可见，本试验采用紫外分光光度法测定LOX酶活性的原理实质是测定LOX反应产物脂氢过氧化物HPOD的增加速率，因为HPOD在234 nm处有光吸收。毛尖茶叶LOX对热相对稳定，在50 ℃时活性最高，即使60 ℃处理1 h，酶仍表现出一定的活性。用70 ℃处理1 h后，酶已经失活，因此活性迅速下降。

3 结论

本研究通过对毛尖茶叶中脂氧合酶（LOX）活性影响因素即最适温度、最适pH值的研究，从而确立了一个适合毛尖茶叶LOX活性测定的体系，即毛尖茶叶经粉碎机粉碎后，取10 g毛尖茶叶加200 mL的麦氏缓冲溶液溶解并过滤，将上清液用高速冷冻离心机离心（12 000 r/min，5 min），上清液加（NH4）2SO4 30%饱和度，冰箱中4 h后继续离心（12 000 r/min，5 min），于上清液中加（NH4）2SO4 70%饱和度，冰箱中过夜，再继续离心（15 000 r/min，10 min）后弃去上清液并加15 mL的麦氏缓冲液溶解沉淀，摇匀后用于LOX活性测定。在3 mL的反应体系中加入pH值为6.3的麦氏缓冲液2 500 μL、亚油酸钠母液300 μL、粗酶液0.2 mL。在 50 ℃ 反应1 min时记录1个数据，到5 min时再记录1个数据，于234 nm处测定LOX的活性，记录D234 nm值的变化，酶活性以ΔD234 nm/（g·min）来表示。茶叶中脂氧合酶有着较好的热稳定性，60 ℃保温1 h后仍具有一定的活性，50 ℃保温1 h可能对该酶的活性有激活作用。通过对茶叶中脂氧合酶活性测定体系的确定，为进一步探讨都匀毛尖茶独特香味的形成机理、改良毛尖茶叶的品质提供理论基础。

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