藏猪粪便芽孢杆菌基因组DNA的提取方法

周彪+郭政宏+严亨秀

摘要：藏猪源的芽孢杆菌制剂具有潜在研究应用价值，更好地提取其基因组DNA对后期研究具有重要作用。采用微波法、酚/三氯甲烷法、改进CTAB法、试剂盒法等4种方法提取同一份藏猪粪便DNA，测定所得DNA含量及纯度，然后对DNA进行16S rRNA基因扩增并使用琼脂糖凝胶电泳法对比。结果表明，4种方法均能提取到藏猪粪便的芽孢杆菌基因组DNA，微波法虽然得到最多的DNA，但是其蛋白质含量过高，DNA纯度最低；试剂盒法提取的DNA纯度最高，但是DNA含量太低；综合比较，改进CTAB法DNA得率多且纯度高，性质稳定，扩增效果好，价格低廉，是最优提取方法。

关键词：藏猪；粪便；基因组DNA；提取方法

中图分类号： S852.6

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0093-02

藏猪别称藏香猪，原产于中国青藏高原海拔2 500～4 300 m 的农区和半农区。藏猪保存了较为纯正的品系资源，是唯一能适应高原海拔气候和以放牧为主的猪种，是我国特有世界珍稀的草食性优良品种[1]。藏猪肉质优良，主要源于其食草特性和生活环境，也与其不同于其他猪种的特殊胃肠道环境有着密不可分的关系。芽孢杆菌制剂通常都是以休眠孢子的形式存在，进入动物肠道后，孢子能在肠道上部迅速萌发、增殖，并分泌很多种活性很强的消化酶，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，同时可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，增强肠道对厌氧益生菌的定植，抑制致病菌生长，平衡、稳定乳酸杆菌，维持肠道微生态平衡[2-5]。

藏猪来源的芽孢杆菌制剂具有潜在的开发研究价值，提取其基因组DNA在开发研究中具有重要的意义，理想的基因组DNA获取方法除了考虑到DNA的产率，还要考虑到尽可能减少DNA的降解及试剂成本等。目前，已经有多种提取微生物基因组DNA的方法[6-8]，如微波法、酚/三氯甲烷法、CTAB法、试剂盒法等。为了探究不同方法获取的基因组DNA对芽孢杆菌研究的影响，本试验采用4种方法对样品进行基因组DNA的提取，通过紫外可见分光光度计、琼脂糖凝胶电泳分析不同方法得到DNA的产量、纯度、稳定性，再将获得的基因组DNA进行16S rRNA基因扩增进行对比并评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）裂解液、酚、三氯甲烷、异戊醇、无水冰乙醇、AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒、琼脂糖、磷酸钠缓冲液（pH值7.0）、10%SDS溶液、TAE缓冲液、TE缓冲液、LB液体培养基等。

1.1.2 试验样品 采集于西藏林芝地区一牧民家中公藏猪新鲜粪便，-80 ℃液氮保存带回实验室。

1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪，东胜龙ETC811；高速冷冻离心机，Thermo；紫外可见分光光度计，上海成光仪器有限公司；凝胶成像系统，Tanon；电泳仪，Tanon；电泳槽，Tanon；微量移液器，Eppendorf；电子天平，江苏省常州市宏衡电子仪器厂；涡旋振荡器，北京优晟联合科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理 称取冻存的粪便样品5 g于4 ℃冰水或冰盒上解冻，置于50 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，并充分涡旋混匀，纱布过滤后，收集滤液并于沸水浴中处理 5 min，吸取1 mL热处理后的滤液加入到19 mL LB液体培养基中，振荡培养24 h，4 ℃保存备用。

1.2.2 基因组DNA的提取

1.2.2.1微波法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心2 min，再用PBS洗涤菌体2～3次；（2）弃上清，加500 μL 1×TE吹打混匀，取100 μL于200 μL EP管，12 000 r/min离心2 min；（3）弃上清，加100 μL 1×TE吹打混匀，12 000 r/min离心2 min；（4）弃上清，加100 μL 1×TE吹打混匀，用微波炉（先预热1 min）加热1 min，12 000 r/min 离心2 min；（5）收集上清液，即为所提DNA。

1.2.2.2 酚/三氯甲烷法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于 1.5 mL EP管中，10 000 r/min离心3 min，弃上清；（2）加入 500 μL STE液悬浮，加10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，37 ℃ 恒温水浴20 min，再加入10% SDS 20 μL，10 mg/mL PKA 20 μL；（3）置于55～65 ℃恒温水浴中1～3 h；（4）500 μL 酚-三氯甲烷-异丙醇（体积比为25 ∶24 ∶1），下层生成牛奶色，混匀后10 000 r/min离心4 min；（5）上一步后分3层，用剪了头的枪头吸取上层DNA，加入异丙醇-三氯甲烷 500 μL，10 000 r/min离心3 min，收集上清；（6）加入30 μL 5 mol/L NaCl，1 000 μL冰无水乙醇，混匀后，冰上静置10 min至出现白色丝状物，10 000 r/min离心3 min，弃上清；（7）加入500 μL 70%乙醇，10 000 r/min离心2 min，弃乙醇，风干约30 min；（8）加入100 μL 无菌水即为所提DNA。

1.2.2.3 改进CTAB法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min离心2 min，弃上清，用0.85% NaCl溶液洗涤2次，加550 μL 1×TE吹打混匀；（2）加8 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，37 ℃恒温水浴30 min，再加40 μL 10% SDS混匀，37 ℃恒温水浴30 min，再加入100 μL 5 mol/L NaCl混匀，加80 μL CTAB NaCl溶液混匀，65 ℃恒温水浴10 min；（3）再加入8 μL 10 mg/mL Rnase，37 ℃恒温水浴 1 h；（4）加入等体积（0.7～0.8 mL）三氯甲烷-异丙醇（体积比为24 ∶1），轻轻振荡混匀，14 000 r/min离心12 min，分3层，收集上清液，加入等体积酚-三氯甲烷-异丙醇（体积比为25 ∶24 ∶1），轻轻振荡混匀，14 000 r/min离心 10 min；（5）收集上清液，加入等体积三氯甲烷-异丙醇（体积比为24 ∶1），轻轻振荡混匀，14 000 r/min离心10 min，收集上清液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃静置30 min，14 000 r/min离心 10 min，弃上清，加入500 μL 70%乙醇，混匀；（6）14 000 r/min 离心3 min，弃上清，风干 15 min，将沉淀溶于60 μL ddH2O中，即为所提DNA。

1.2.2.4 试剂盒法 采用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒，具体步骤参见说明书。

1.2.3 基因组DNA质量检测 分别采用紫外可见分光光度计法、1%琼脂糖凝胶电泳法、PCR扩增法分析所提取基因组DNA的得率、纯度以及大小。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA得率及纯度

对藏猪粪便进行沸水浴处理5 min，只有芽孢杆菌可以存活于沸水浴中，其他细菌已被杀死。将4种方法所提取的基因组DNA稀释100倍，用紫外可见分光光度计测定DNA得率及纯度，每个样品DNA测定3次，取其平均值，得到DNA提取含量、DNA纯度和蛋白质含量。DNA得率测定标准：D260 nm值为1时等同于50 μg/mL双链DNA，D260 nm/D280 nm比值在1.7～1.9之间，则说明所测样品DNA 纯度较高；比值低于1.7，则可能有蛋白等杂质污染；高于2.0，则样品DNA很可能已经降解。从表1可以看出，DNA得率微波法>改进CTAB>试剂盒法>酚/三氯甲烷法；DNA纯度试剂盒法>改进CTAB>酚/三氯甲烷法>微波法；蛋白含量微波法>改进CTAB>试剂盒法>酚/三氯甲烷法。改进CTAB法的DNA得率和纯度均是第2位；微波法得率最高，但是其蛋白含量最高，导致DNA纯度最低；试剂盒法得率居第3位，DNA纯度最高且蛋白含量最少；酚/三氯甲烷法得率最低且DNA纯度居于第3位。微波法和酚/三氯甲烷法的D260 nm/D280 nm比值均低于170，接近1.0，这2种方法提取的DNA污染较严重，改进CTAB法和试剂盒法分别是1.69、176，属于纯度较高的DNA。试剂盒法需要价格昂贵的试剂盒。综合考虑以上因素，改进CTAB法最适合于藏猪粪便中芽孢杆菌基因组DNA的提取。

2.2 基因组DNA电泳检测

1%琼脂糖凝胶电泳法检测结果（图1）表明，4种方法提取的基因组DNA分子质量均在23 000 bp左右，酚/三氯甲烷法所提DNA拖尾较严重，表明含杂质较多，其余3种方法所提基因组DNA较为完整且纯度较高，电泳条带清晰。图2为基因组DNA在-20 ℃冰箱存放24 h后所得电泳，微波法提取的基因组DNA降解量最多，表明DNA含有太多杂质。其他3种方法基因组DNA均有相似程度的降解。

2.3 16S rRNA基因PCR扩增后效果

用细菌16S rRNA基因通用引物扩增所提基因组DNA，使用1% 琼脂糖电泳法检测，以Marker DL2000作为标准分子质量参照，通过凝胶成像系统成像（图3），4种方法PCR扩增效果都较好，扩增的片段大小在15 000 bp左右，且干扰性杂带不多，重现性较好，但微波法、改进CTAB法和试剂盒法获得的条带较清晰，酚/三氯甲烷法的条带较模糊，表明微波法、改进CTAB法和试剂盒法提取的基因组DNA具有较好的质量，所得的 DNA 可作为 PCR 模板进行16S rRNA 基因的有效扩增，为进行后续的试验研究提供材料保障。

3 结论与讨论

微波法只有洗涤、微波振荡破壁和酚/三氯甲烷抽提3步，相对于物理法破壁的费时、费力和酶法破壁的长时间消化处理，微波法具有简便、高效、快速和价廉等特点[9]。虽然微波法能提取到高得率的DNA，但所提DNA中含有太多杂质，以致其稳定性极差，很可能是因为未进行核酸酶消化处理。酚/三氯甲烷抽提方法是目前提取外周血基因组DNA方

法，可除去蛋白质和色素物质，研究表明，酚/三氯甲烷法可提取高纯度的DNA[10]。在本试验中，酚/三氯甲烷法提取的基因组DNA得率最低，DNA纯度居于第3位，可能与酶消化细胞壁时间不足、萃取不彻底有关。改进CTAB法提取的基因组DNA得率和纯度均居第2位，综合考虑是提取藏猪粪便芽孢杆菌基因组DNA的最优方法。CTAB法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测和16S rRNA扩增表明，该法提取的DNA蛋白质污染少，降解不明显，产量稳定，重复性好，可做大量提取试验并应用于后续研究。试剂盒法操作简单，用时相对较短，所得DNA质量较为稳定，但价格昂贵，使用次数有限，不适合作大量基因组DNA提取。不同方法出现的差异可能与不同方法裂解细菌细胞的效率及藏猪粪便中特异菌群组成有关。用4种方法提取同一份样品DNA的得率和纯度差异较大，说明对肠道菌群研究时采用不同DNA提取方法会影响对菌群多样性的分析，导致引入一些误差，因此，在研究不同动物肠道菌群时应选择合适的方法提取DNA以减少菌群分析误差。

参考文献：

[1]贺寒冰，尹洛蓉，杨 肖，等. 藏猪和长白猪对口蹄疫疫苗的免疫应答特性比较研究[J]. 四川动物，2011，30（4）：517-521.

[2]胡东兴，潘康成. 微生态制剂及其作用原理[J]. 中国饲料，2001（3）：14-16.

[3]何明清，程安春. 动物微生态学[M]. 成都：四川科学技术出版社，2004.

[4]刘学剑. 饲用芽抱杆菌的研究和应用[J]. 广东饲料，2005（14）：30-32.

[5]黎春辉. 芽孢杆菌与部分抗菌中草药联合应用的研究[D]. 长沙：湖南农业大学，2008：1-7.

[6]陈思媛，郭明璋，贺晓云，等. 用于分子生物学检测的粪便DNA的提取方法优化[J]. 农业生物技术学报，2013，21（12）：1509-1517.

[7]Tang J N，Zeng Z G，Wang H N，et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods[J]. Journal of Microbiological Methods，2008，75（3）：432-436.

[8]郑 刚，陈己任，胡博文，等. 基于DGGE分析的大鼠粪便及肠道细菌DNA提取方法研究[J]. 食品科学，2011，32（17）：215-218.

[9] Orsini M，Romano-Spica V. A microwave-based method for nucleic acid isolation from environmental samples[J]. Lett Appl Microbiol，2001，33：17-20.

[10]刘正旺，云美玲，钟江华，等. 提取陈旧血液标本中DNA的三种方法比较[J]. 中国热带医学，2012，12（3）：321-323.赵 满，李丽芳，王友竹，等. 黄粉甲翅芽生长因子基因的克隆及表达分析[J]. 江苏农业科学，2016，44（4）：95-98.