除草剂草甘膦微生物降解技术研究进展

王军华+王易芬+陈蕾蕾+周庆新+杜方岭

摘要：草甘膦是目前世界上使用量最大的除草剂品种之一，造成日益严重的环境污染和生态危害，并随着食物链在哺乳动物体内富集，进而危害人类健康；微生物降解是清除环境中草甘膦的最主要途径，是降低草甘膦危害的一种有效方法。对近几年筛选得到的草甘膦高效降解菌、主要降解途径和降解产物、草甘膦的原位修复研究进行了总结，探讨了微生物降解用于缓解草甘膦造成的环境污染的难题。

关键词：草甘膦；微生物降解；降解途径；原位修复

中图分类号： S482.4；S182

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0008-04

草甘膦（glyphosate）是一种高效除草剂，被植物经茎叶吸收后，通过抑制植株5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性来干扰5-烯醇式莽草酸-3-磷酸的合成，从而抑制植株合成芳香性氨基酸，最终导致植物叶片枯黄脱落，死亡[1-2]，可控制世界上绝大多数危害性杂草，成为全世界除草剂使用量最大的种类之一[3]。

草甘膦由Monsanto公司开发应用以来，一直被认为对非靶标生物具有低毒性。对草甘膦及其制剂的研究显示，草甘膦未在任何动物的组织中富集，也未对人类健康产生危害[3]。然而40多年的应用，尤其是1983年高抗草甘膦基因研发后[4]，抗草甘膦转基因作物被广泛种植，引起的草甘膦大规模应用，导致其在土壤中大量积累，已经对土壤化学过程和生态系统造成影响，而且给环境带来安全风险，威胁了人类健康[5]。调查研究发现，土壤中残留的草甘膦会破坏土壤微生态，影响微生物数量和土壤酶的活性，尤其会抑制放线菌数量和脲酶的活性[6-7]，而且残留的草甘膦会随地表径流进入地表水，影响水质，造成水生生态的失衡[8-9]。不仅如此，更有研究发现，草甘膦会影响孕期动物的胚胎发育，导致形态异变[10-12]。例如，干扰海胆胚胎细胞的细胞周期[10]，增加非洲爪蛙的胚胎和鸡胚变异的可能性[11]等。同时，Clair等对小鼠研究发现，高剂量的草甘膦（约10 000 mg/kg）对小鼠睾丸的支持细胞有急性细胞毒性，诱导细胞坏死和凋亡；而低剂量的草甘膦（1 mg/kg，相当于摄食草甘膦处理的玉米后，人尿液中草甘膦的含量），虽然没有细胞毒性，但是会使睾丸酮的分泌降低35%，干扰睾丸的内分泌[12]。Poulsen等还发现，草甘膦能够穿透人类胎盘障碍进入胎儿室，影响胎儿正常发育[13]。由此可见，土壤中富集的草甘膦不仅对环境造成影响，破坏生态平衡，并能通过食物链的富集进入哺乳动物体内，进而威胁人类健康，草甘膦的安全问题应引起人们的足够重视。

1 草甘膦的生物降解菌

土壤中的草甘膦易发生水解、光化学降解、生物降解等，而生物降解是草甘膦降解的最主要途径[14-15]。在自然环境中，尤其是长期施用草甘膦的土壤中，存在种类繁多的能耐受或降解草甘膦的微生物菌群[16]，这有利于寻找高效降解菌，对缓解草甘膦造成的环境危害具有重要意义。

在纯培养条件下，科学家们一直没能分离出可利用草甘膦的细菌，直至1983年，Moore等筛选出假单胞菌PG2982，是能利用草甘膦作为唯一磷源的细菌[17]。同位素标记法研究发现，通过C—P键的断裂，PG2982能将草甘膦代谢成肌氨酸[18]，虽然PG2982降解草甘膦延滞期较长，但是为草甘膦降解菌的筛选奠定了基础。此后，陆续分离得到有草甘膦降解活性的假单胞菌[19-23]、产碱杆菌[23]、黄杆菌[24]、节杆菌[25-26]和根瘤菌[27]，而Krzysko等则发现土壤中的真菌也具有降解草甘膦的能力[28-29]。早期研究的降解菌多是以草甘膦为唯一磷源，随着研究的深入，发现许多微生物也可以利用草甘膦作为碳氮源，节杆菌GLP-1的变种[26]、产黄青霉菌[30]被发现能利用草甘膦作为唯一氮源，链霉菌[31]则是将草甘膦作为唯一碳氮源，而青霉T1[32]和曲霉B21[33]对草甘膦也都表现出明显降解特性，降解率都在50%以上，B21对草甘膦的降解率甚至可达97%。

近年来，草甘膦的研究也取得许多进展，Sviridov等分别从甲基膦酸和草甘膦污染的土壤中分离出无色杆菌MPS12和苍白杆菌GPK3，将MPS12在含草甘膦的培养基中培养，MPS12A同样具有降解草甘膦的能力，这2株菌都是以草甘膦为唯一磷源进行生长，将草甘膦分别降解成肌氨酸和AMPA[34]。Hadi等在无膦培养基中也筛选出苍白杆菌GDOS，能将草甘膦降解为AMPA，GDOS在含磷培养基中对草甘膦还有降解能力，并且是报道的第一个能在几天内将毫摩尔草甘膦完全降解的纯菌，这对于污染土壤修复和废水治理具有重要意义[35]。康纪婷等对采自农药厂污水处理池的活性污泥样本进行筛选，共分离27株解磷细菌，复筛后发现假单胞菌BR13、摩根氏菌BR57对草甘膦都有降解作用，降解率均在50%以上[36]。Selvi等发现的假单胞菌T5以草甘膦为唯一磷源，并且在该菌中首次分离了有C—P裂解活性的酶[37]。Moneke等对不同菌株进行草甘膦降解特性的研究，发现荧光假单胞菌和醋酸杆菌在含7.2～25 mg/mL草甘膦培养基中显著增长，表现出较强的草甘膦降解特性[38]。Kryuchkova等从根瘤菌中筛选出5株能耐受草甘膦的细菌，进一步筛选出阴沟肠杆菌K7，该菌以草甘膦为唯一磷源，将其降解为肌氨酸，不仅如此，这类细菌还能侵入向日葵和甜高粱的根部，促进根苗的生长，有益于草甘膦污染土壤的治理和修复[39]。

由Fan等分离出的蜡样芽孢杆菌CB4是以草甘膦为唯一碳源，对草甘膦降解率可达94.5%，是第一个报道的能降解草甘膦的蜡样芽孢杆菌[40]。其后，Zhan等分离出的蜡样芽孢杆菌HYC-7，则是以草甘膦为唯一氮源生长[41]。而韩丽珍等从长期使用草甘膦的土壤中筛选得到节杆菌HX-5，以草甘膦为唯一碳氮源，降解率达到74.8%[42]。叶明等也发现节杆菌A5能以草甘膦为碳氮源，72 h对草甘膦的降解率达94.2%[43]。多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9是李冠喜等筛选出的高效解磷细菌，在生物降解农药残留功能的研究中发现，该菌在以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源培养基上均能正常生长，优化发酵条件后，试验条件下该菌对草甘膦的降解率最高可达72.8%[44]。汤明强等发现胶红酵母能以草甘膦为唯一碳氮源[45-46]，而吴学华等发现的米曲霉A-F02，能以草甘膦为碳源，培养7 d对草甘膦的降解率为86.8%[47]。

2 微生物对草甘膦的降解途径

随着草甘膦降解菌研究的深入，菌株的降解途径也逐渐被阐明，微生物主要通过2条途径降解草甘膦，碳磷键（C—P键）断裂生成肌氨酸和碳氮键（C—N键）断裂生成氨甲基膦酸（AMPA）（图1）[48]。

2.1 肌氨酸途径

由Moore等筛选出的第1株草甘膦降解菌假单胞菌PG2982，是通过肌氨酸途径降解草甘膦[17]，C—P键对化学反应和酶促反应有很高的稳定性，在微生物C—P裂解酶的作用下，草甘膦C—P键断裂，生成肌氨酸，为细菌生长提供磷源。此前，因为C—P裂解酶在胞外容易发生不可逆转的失活，这使得草甘膦特异性的C—P裂解酶一直是个谜[49]。最近，Selvi等从恶臭假单胞菌T5中分离出有活性的C—P裂解酶，从而揭开了该酶的神秘面纱。这是第1个纯化出的草甘膦特异性的C—P裂解酶，活性比无细胞萃取液提高600多倍，这对于草甘膦降解菌的深入研究有重要意义[37]。另一方面，生成的肌氨酸在肌氨酸氧化还原酶的作用下，快速代谢生成甲醛和甘氨酸，参与微生物的多个生理循环[18，50]。

2.2 AMAP途径

参与氨甲基膦酸（AMPA）途径的酶主要是草甘膦氧化还原酶（GOX），在该酶作用下，草甘膦C—N键断裂，生成氨甲基膦酸（AMPA）和乙醛酸[48]。截至目前，还没有发现单一微生物能通过该途径完全矿化草甘膦，大部分AMPA被微生物分泌出胞外进入环境，或被其他微生物吸收，发生C—P键断裂，最终矿化；乙醛酸则作为三羧酸循环的底物，参与微生物正常的代谢途径[19，24-25，48，51]。最近，Sviridov等发现磷酸水解酶可能参与了苍白杆菌GPK3的AMPA降解，并提出一个假设：AMPA首先在转氨酶的作用下，生成磷酸甲醛，进而作为磷酸水解酶的底物，发生水解，生成甲醛和磷酸（图2）[34]，然而到目前为止，磷酸水解酶在AMPA代谢途径中的作用也仅限于假设，还没有研究提出直接的证据证明这一假设[23，52]。

研究还发现，1株降解菌还可能同时存在2种降解方式，例如GPK3，主要是经过AMPA途径降解草甘膦，同时还能检测到痕量的肌氨酸[34]，表明GPK3也可通过C—P键断裂降解草甘膦，相同的现象也出现在假单胞菌LBr的降解中[19]。

而Dick等对筛选出的163株微生物进行筛选，发现筛选出的26株降解菌在磷饥饿的情况下能以草甘膦为唯一磷源将其降解，生成肌氨酸而不是AMPA[53]。进一步研究发现，肌氨酸途径在磷缺乏情况下才会发生，而环境中大都存在充足的磷源，能满足微生物的需求，因此草甘膦在环境中主要代谢生成AMPA[16]，而肌氨酸途径只存在于实验室磷饥饿压力下筛选出来的降解菌中。这些表明，在实验室条件下，经过肌氨酸途径代谢的降解菌，是将草甘膦作为唯一磷源，诱导C—P裂解酶生成，而在自然环境下，环境中充足的磷源会负调节裂解酶，降解菌失去裂解草甘膦的能力；同时，不同于实验室培养，恶劣的自然环境也造成筛选菌株的不生长和降解能力的丧失，这都给草甘膦的实际应用提出了难题[19，26，54]。

可以看出，草甘膦降解菌的降解方式复杂多变，还需进行深入研究，而缺少准确、可靠的酶活性测定方法限制了对酶活性的研究。对草甘膦代谢途径和降解活性的研究，以同位素标记的草甘膦为底物，经代谢后，对降解产物进行NMR研究，是研究草甘膦代谢途径的一种有效方法[19，55]，但该方法对设备要求高。或将草甘膦及其代谢产物衍生化[40，56]，衍生化后经过不同检测手段，如高效液相色谱[56-57]、气相色谱[58-61]、薄层色谱[25，62]、毛细管电泳[63-64]等，对降解产物及降解途径进行分析，用于鉴别草甘膦氧化还原酶和C—P 裂解酶的活性；但试验中发现，发酵液中成分复杂，不同成分发生交叉，影响目标产物的辨识，干扰测定结果的准确性。因此，探寻精确、有效的草甘膦及其代谢产物的分析方法，对于解析草甘膦代谢方式，阐明微生物降解草甘膦的机理具有重要意义。

3 原位修复研究

目前，生物降解草甘膦还局限于实验室研究阶段，用于原位修复草甘膦污染的研究还很少，仅有少数土著微生物降解草甘膦的研究被报道[65-66]。而在分离的纯菌原位修复研究中，Shushkova等在被污染土壤中引入人苍白杆菌GPK3和无色杆菌Kg16，结果表明其对草甘膦的降解率比土著微生物菌群提高了数倍[67-68]。在引入降解菌的1～2周内，污染土壤的草甘膦含量、总体毒性水平、对植物的毒性水平已经恢复至正常土壤水平，而草甘膦浓度降低，使得土壤微生物活性恢复，表现为土著微生物的脱氢酶活性和生物量分别提高了12倍和1.6倍[67]。研究还显示降解能力跟土壤的垂直分布相关，只有土壤表层0～10 cm深的草甘膦可以被土著微生物和引入的微生物迅速降解，而10～30 cm深的土壤会因为没有降解菌GPK3，并且土著微生物的数量少而发生草甘膦蓄积，同时草甘膦会随着时间推移渗入土壤深处，雨水加速这一过程，影响草甘膦的降解[68]。

目前为止，还没有1株筛选得到的纯菌成功用于原位修复草甘膦污染的实例，主要原因在于，与其他微生物降解所遇到的难题相同，引入的微生物的生存竞争力不如土著微生物，同时恶劣的环境条件也不利于降解菌生存，使之在生存竞争压力下没有余力修复污染[54]；而且，原位修复研究发现，土壤中充足的磷源抑制微生物对草甘膦的利用，实验室筛选得到的高效降解菌，在实际应用中却无法发挥作用[19，26]。

4 结语

草甘膦的使用，在造福人类的同时，也带来严重的环境和生态危害，微生物降解低毒、低耗，不会引入新污染，对于农药的治理是一种有效的手段，并且，环境残留的草甘膦主要通过微生物降解，这引导科学家们在草甘膦降解菌的筛选上进行努力，试图找到有效方法，缓解或消除草甘膦带来的环境危害。目前，已经发现多种微生物能以草甘膦为唯一的磷源、碳源或氮源，表现出极高的降解率，但目前的研究还仅仅处于实验室阶段，还没有在原位引入降解菌，成功修复受污染体系的应用实例。而且，在考虑生物修复有效性的同时，外源生物的引入是否会带来二次污染和生态危害，都需要考虑、研究和解决，这给生物修复环境污染的实际应用提出更多挑战。

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