“对叶大戟”总黄酮的提取及其抗氧化活性研究

再乃普古丽·伊斯马伊力，外塔尼古丽·卡米力，阿布拉江·克依木（新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830046）

“对叶大戟”总黄酮的提取及其抗氧化活性研究

再乃普古丽·伊斯马伊力，外塔尼古丽·卡米力，阿布拉江·克依木*（新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830046）

摘要：研究“对叶大戟”总黄酮的提取工艺及其体外抗氧化活性。在单因素试验的基础上，选定乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度等4个因素对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响。选用L9（34）表进行正交试验，确定从“对叶大戟”中提取黄酮类化合物的最佳工艺条件为乙醇浓度为50%，料液比1∶25（g/mL），提取时间30 min，超声温度30℃。在此条件下提取的“对叶大戟”总黄酮含量为3.5%。影响总黄酮提取率所选的因素主次顺序为：提取时间（D）＞提取温度（A）＞料液比（C）＞乙醇浓度（B）。抗氧化性试验结果表明，对叶大戟总黄酮对羟基自由基、DPPH自由基清除能力。即“对叶大戟”总黄酮的抗氧化活性强于VC。

关键词：对叶大戟；总黄酮；提取工艺；抗氧化

“对叶大戟”（Euphorbia Sororia A）为大戟科大戟属一年生草本植物，以全草入药和果实入药，主要分布于中亚和我国新疆和田等地区［1-2］。该药材里面含有较多的黄酮类化合物。黄酮类化合物是天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基的生理活性，对人类和动物健康有好处，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抗癌、抗炎等功能［3-4］。“对叶大戟”是维吾尔医学常用药材，主治功能为利水消肿、降压清脑、泻下杂虫。用于大便秘结、尿频、高血压头痛、肝硬化、水肿以及疥疮肿痛等［5］。本文对维药材“对叶大戟”进行提取及其体外抗氧化活性研究。由于一些人工合成的抗氧化剂发现有毒性，不安全等问题，因此近年来从植物中提取的天然黄酮类化合物已广泛应用于食品工业，此为天然抗氧化剂具有安全、无毒且具有抗癌、抗衰老和防治心脑血管疾病的作用和无污染等优点已经越来越受到人们的重视。开发新的天然抗氧化剂是食品和医药工业的一项重大课题［6］。因此“对叶大戟”中化学成分的提取分离与分析研究，对其开发利用“对叶大戟”具有重要的科学意义和学术价值。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

“对叶大戟”（Euphorbia sororia A）药材于2011年8月在新疆和田地区采集的，芦丁（纯度为99.99%），乙醇、甲醇、石油醚、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻二氮菲（1，10-菲啰啉）、硫酸亚铁、过氧化氢、DPPH试剂（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基）VC标准品（抗坏血酸）均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

瑞士R-200 BUCHI旋转蒸发仪：乌鲁木齐市祥生仪器有限公司；VIS-723型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；KQ5200B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；WS210S型电子天平：北京赛多利天平有限公司。

1.3试验方法

1.3.1标准曲线的绘制

准确称取在120℃干燥恒重的芦丁标准品20.0mg，置于100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液溶解，定溶到100 mL，摇匀，配制浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液。取芦丁标准溶液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 .0 mL，再用70%乙醇溶液稀释至刻度，放置15 min后，在450 nm～800 nm波长范围内扫描，结果在510nm处有最大吸收峰。分别吸取浓度为0.200 mg/mL的芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL，于25 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；再加入4%氢氧化钠溶液10.0 mL，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置10 min～15 min，以无芦丁溶液作为空白对照试验。在510 nm处测得不同浓度下吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标进行回归，绘制标准曲线。

其回归方程为：Y = 12.665x-0.006 4，相关系数R2= 0.999 6。

1.3.2“对叶大戟”中总黄酮的含量测定

准确称取一定量的“对叶大戟”药材，用适量的50%乙醇超声提取30 min，抽滤，减压浓缩回收乙醇，将浓缩物用50%乙醇溶解，摇匀，定容50 mL容量瓶中。取此样品液2 mL置于25 mL容量瓶中，然后在510 nm处按1.3.1的方法测定样品的吸光度Y，将吸光度值带入标准曲线的回归方程得到样品溶液浓度，用下面计算公式计算（超声波辅助提取法）的“对叶大戟”样品中总黄酮含量。原料中总黄酮含量计算公式：

式中：c为测定出来的浓度，mg/mL；v为样品溶液的总体积，mL；n为稀释陪数；m为样品质量，g。

1.3.3“对叶大戟”黄酮的提取

1.3.3.1乙醇浓度对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响

称取1.0g粉末状“对叶大戟”5份，分别加入20mL 的50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，提取温度为30℃，在超声波辅助条件下提取30 min，抽滤，减压浓缩回收乙醇，定容于50 mL容量瓶中，并确定吸光度值。

1.3.3.2提取时间对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响

称取1.0g粉末状“对叶大戟”5份，分别加入20mL 60%乙醇溶液，提取温度30℃，在超声波辅助条件下分别浸泡15、30、45、60、75 min，抽滤，减压浓缩回收乙醇，定容于50 mL容量瓶中，并确定吸光度值。

1.3.3.3料液比对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响

称取1.0 g粉末状“对叶大戟”5份，分别加入10、15、20、25、30 mL 60%乙醇溶液，提取温度为30℃，提取时间为45 min，抽滤，减压浓缩回收乙醇，定容于50 mL容量瓶中，并确定吸光度值，考察料液比对提取效果的影响。

1.3.3.4提取温度对“叶大戟总”黄酮提取率的影响

称取粉末状1.0 g“对叶大戟”5份，分别加入20 mL 60%乙醇溶液，提取温度分别为30、35、40、45、50℃，提取时间为45 min，减压浓缩回收乙醇，定溶于50 mL容量瓶中，并确定吸光度值，考察提取温度对提取效果的影响。

1.3.4正交试验设计

在单因素试验的基础上，分别研究料液比，乙醇浓度，提取时间，提取温度对"对叶大戟"中黄酮提取的影响，做四因素三水平正交试验设计，优化对叶大戟中黄酮的提取工艺。因素水平见表1。

表1　正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5体外抗氧化活性的检测

1.3.5.1清除羟自由基（·OH）能力的测定

参照文献［7］的方法，在10 mL具塞容量瓶中，加入1.50 mL 5 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液和2.0 mL 0.2 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液4.0 mL，充分混匀，再加入1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亚铁溶液，立即混匀后加入1.0 mL 1%过氧化氢溶液启动反应，于37℃水浴中60 min保温，于536 nm处测定吸光度A1。用1.0 mL蒸馏水代替过氧化氢溶液及测定吸光度A2。用样品液1.0 mL代替1.0 mL蒸馏水测定吸光度A3。VC做阳性对照。计算公式为：

1.3.5.2清除DPPH自由基能力的测定

参照文献［8］的方法，分别吸取样品溶液2.0 mL，加入0.04 mg/mL DPPH乙醇溶液2.0 mL，反应20 min后，于517 nm处测定吸光度Ai。同时，测定2.0 mL样品溶液与2.0 mL乙醇混合液在517 nm处测定吸光度Aj，再测定2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL乙醇溶液在517 nm处测定的吸光度Ao。每处理重复3次。VC做阳性对照。计算样品溶液对DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率/%=［1-（Ai-Aj）/Ao］×100

式中：Ao为DPPH溶液与乙醇溶液的吸光度；Ai为加入样品后的DPPH溶液的吸光度；Aj为样品溶液与乙醇溶液的吸光度。

1.3.5.3总抗氧化力测定

参照文献［9］的方法取某一浓度的样品溶液1.0mL，分别加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL和1%K3Fe（CN）6溶液2.5 mL，混合后在50℃水浴中反应20 min后迅速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混合，取混合液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.1%FeCl3溶液2.5mL，充分混匀，静置10 min后于700 nm处测定吸光度A。VC做阳性对照。以A700代表还原力强度，A越大，还原力越大。

2　结果与讨论

2.1标准曲线的绘制

按前述方法1.3.1，在510 nm处测定不同浓度的芦丁标准溶液的吸光度值，以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线见图1。由图1可知，当标准品含量为0.03 mg/mL～0.04 mg/mL时与吸光度值有良好的线性关系。

图1　芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2单因素试验

2.2.1乙醇浓度对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响

按前述方法1.3.3.1，乙醇浓度对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响测定结果由见图2。

图2　乙醇浓度对“对叶大戟”黄酮提取率的影响Fig．2 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of total flavoniods

由图2可以看出，当乙醇浓度达到60%时，黄酮类化合物溶解度最大，吸光度最高。乙醇浓度再增加，黄酮类化合物溶解度减小，同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇水分子结合，从而导致黄酮化合物提取率下降。因此，本试验60%乙醇选为提取溶剂。

2.2.2提取时间对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响

按前述方法1.3.3.2，提取时间对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响测定结果见图3。

图3　提取时间对“对叶大戟”黄酮提取率的影响Fig．3 Effects of extraction times on the yield of total flavonoids

从图3可以看出，随着时间的延长，黄酮类化合物的提取率逐渐增加，在提取时间为15 min～30 min内的提取率变化最大，提取时间为30 min后影响不大，吸光度值基本保持稳定，提取率趋于平缓。如果提取时间过短，因黄酮类化合物没有完全提取而提取效率低，提取时间过长，会导致黄酮类化合物被氧化而破坏，造成提取率还是降低，同时，不利于生产周期，会增加生产成本和消耗，因此选45 min为最佳提取时间。

2.2.3料液比对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响

按前述方法1.3.3.3，料液比对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响测定结果见图4。

图4　料液比对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响Fig．4 Effects of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

从图4可以看出，随着料液比的增大，先提取总黄酮量逐渐增大，当料液比为1∶20（g/mL）时吸光度最大就提取效率好，而后随着料液比继续增加，提取量则有下降。适量的溶剂量有利于黄酮类化合物的提取效率，料液比过低时，会导致提取溶剂的饱和现象就不利于黄酮类化合物的提取效率，料液比过大，溶剂消耗量太多，会给后续的浓缩工作增加困难。因此，从提取效率和实验成本的角度来考虑，选择料液比1∶20（g/mL）为宜。

2.2.4温度对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响

按前述1.3.3.4方法，温度对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响测定结果见图5。

图5　提取温度对“对叶大戟”总黄酮提取率的影响Fig．5 Effects of extraction temperature on the yield of total flavonoids

从图5可以看出，随温度的升高，先黄酮类化合物的吸光度升高而后随着温度的升高降低。当温度35℃时吸光度最大，而超过35℃时吸光度开始下降，提取量则减少，达到40℃～50℃时吸光度变化不大，提取率保持不变。主要原因是由于温度过高时，活性成分容易破坏而提取率下降。考虑黄酮类化合物的热稳定性和提取溶剂的挥发性问题，故35℃可作为最佳提取温度。

2.3正交试验设计及结果

根据正交试验设计以料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度为单因素，对“对叶大戟”中总黄酮类化合物进行提取，按1.3.1标准曲线的测定方法测定提取液的吸光度。以测得的“对叶大戟”中黄酮类物质提取量为考察指标，选用L9（34）正交试验。确定“对叶大戟”总黄酮的最佳提取工艺条件。试验结果如

表2　所示。表2正交试验设计与结果Table 2 Design and results of orthogonal test

由表2可知，影响“对叶大戟”中总黄酮提取率的因素主次顺序为：提取时间（D）＞提取温度（A）＞料液比（C）＞乙醇浓度（B）。由表2可以看出，提取时间对实验的影响最为显著。各种因素的最优组合为A1B3C2D1，即乙醇浓度为50%，料液比1∶25（g/mL），提取时间30 min，超声温度30℃。在此条件下提取的“对叶大戟”黄酮含量为3.5%。

2.4体外抗氧化活性检测结果

2.4.1总黄酮和VC对羟基自由基（·OH）的清除作用

按前述1.3.5.1方法，总黄酮和VC对羟基自由基（·OH）的清除作用测定结果见图6。

图6　样品和VC的羟基自由基清除曲线Fig．6 The scavenging effect of sample and Vc on hydroxyl radical

由图6可以看出，VC标准品溶液和“对叶大戟”总黄酮提取液在Fenton体系中对羟基自由基均有清除作用，并都随样品浓度的增加而增强。VC和总黄酮对羟基自由基的清除率呈现一定量效正相关关系，且随着样品浓度的增加清除能力增强。当样品浓度0.45mg/mL时，VC和总黄酮的清除率分别达到64.55%、84.77%。试验结果表明总黄酮的清除作用大于VC的清除作用，说明“对叶大戟”总黄酮对羟基自由基具有很强的清除作用。

2.4.2总黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用

按前述方法1.3.5.2，总黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用测定结果见图7。

图7　样品和VC的DPPH自由基清除曲线Fig．7 The scavenging effect of sample and VCon DPPH free radical

由图7可以看出，VC标准品溶液和“对叶大戟”总黄酮提取液对DPPH自由基有一定量的清除作用，且随样品浓度的增加清除能力增强。当样品浓度20 μg/mL时，VC和总黄酮的清除率分别达到82.45%、95.76%。故总黄酮的清除率大于VC，说明“对叶大戟”总黄酮对DPPH自由基具有很强的清除作用。

2.4.3总黄酮和VC的还原力

按前述方法1.3.5.3，总黄酮和VC的还原力测定结果见图8。

图8　样品和VC的还原力曲线Fig．8 The reduction oxidation of sample and VC

由图8可以看出，当样品浓度0.25 mg/mL时，VC和总黄酮的吸光度分别为1.202、1.129。VC和“对叶大戟”总黄酮的还原力与样品的浓度成正关系，并随着样品浓度的增加呈现逐渐增强的趋势，说明“对叶大戟”总黄酮表现出较强的还原能力。

3　结论

1）以“对叶大戟”为研究对象，研究提取该药材中总黄酮的最佳工艺条件。在单因素试验的基础上，选定乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度等4个因素的3个水平进行正交试验。正交试验结果显示，最佳提取条件为A1B3C2D1，即乙醇浓度为50%、料液比1∶25（g/mL）、提取时间30 min、超声温度30℃。在此条件下“对叶大戟”黄酮含量为3.5%。本研究采用超声波法辅助提取“对叶大戟”中的总黄酮，用分光光度法测定“对叶大戟”总黄酮含量，方法简便、快速、稳定、提取效率高。正交试验法用于提取工艺优化减少了试验次数、节约了试验成本、这是天然产物有效成分提取工艺优化实验很好的工具，通过正交试验确定了“对叶大戟”中总黄酮的最佳提取工艺条件。这表明“对叶大戟”中含有丰富的黄酮类化合物。这一工艺条件的获得对“对叶大戟”黄酮的提取研究具有一定的参考价值，并为进一步开发“对叶大戟”植物资源提供了一定的理论参考。

2）通过“对叶大戟”总黄酮提取液对羟基自由基和DPPH自由基的清除作用、还原能力的测定可以发现，“对叶大戟”中总黄酮提取液表现出很强的羟基自由基和DPPH自由基的清除率，较高的还原能力，具有良好的体外抗氧化作用，有作为天然抗氧化剂进一步开发利用的价值。

试验结果表明，羟基自由基清除能力测定法和DPPH自由基清除能力测定法中样品具有很强的抗氧化活性，既总黄酮的抗氧化活性强于VC；而在还原能力测定法中VC的抗氧化能力强于总黄酮。研究结果为“对叶大戟”黄酮类成分的进一步分离总黄酮及抗氧化活性的开发利用具有重要的指导意义。

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Study on the Extraction of Total Flavonoids from Euphorbia Sororia A and It's Antioxidant Activities

Zeynepgul ESMAYIL，Wetengul KAMIL，Ablajan KEYUME*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China）

Abstract：The extraction conditions and antioxidant activities of total flavonoids from Euphorbia Sororia A were investigated. The effects of four factors on the extraction，included ethanol concentration，material/ solvent ratio，extraction time，extraction temperature by single factor test. Table L9（34）was used to conduct the orthogonal experiment，the optimum conditions for extracting total flavonoids from Euphorbia Sororia A were：ethanol concentration 50%，material/ solvent ratio 1∶25（g/mL），extraction time 30 min，extraction temperature 30℃. Under these optimum conditions，extraction rate of total flavonoids was 3.5%. Extraction time had the most important effect on extraction，followed by extraction temperature，material/ solvent ratio，ethanol concentration. The results of antioxidation showed that from Euphorbia Sororia A had a certain scavenging activity on OH and DPPH radicals，we found the total flavonoids from Euphorbia Sororia A had stronger antioxidative activity than VC.

Key words：Euphorbia sororia A；total flavonoids；extraction conditions；antioxidation

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.030

基金项目：西部之光人才培养基金项目资助

作者简介：再乃普古丽·伊斯马伊力（1989—），女（维吾尔），硕士研究生，主要从事天然产物的化学成分及其活性研究

*通信作者：阿布拉江·克依木（1976—），男，教授，硕士生导师，研究方向：中药及维吾尔药化学成分及其活性研究。

收稿日期：2015-03-10