3种方法去除葡萄酒中酒香酵母污染效果对比分析

傅晓方，王焕香，商华，白佑铂，朱亚楠，郜成军，赵晓宁，王圣杰（. 中国长城葡萄酒有限公司，河北怀来　075400；. 中粮长城葡萄酒（涿鹿）有限公司，河北涿鹿　075600）



3种方法去除葡萄酒中酒香酵母污染效果对比分析

傅晓方1，王焕香1，商华1，白佑铂1，朱亚楠1，郜成军1，赵晓宁1，王圣杰2
（1. 中国长城葡萄酒有限公司，河北怀来075400；2. 中粮长城葡萄酒（涿鹿）有限公司，河北涿鹿075600）

摘要：酒香酵母是葡萄酒厂常见的微生物污染之一，常存在于空间环境、设备及葡萄酒中。在酿酒过程中，酒香酵母可利用葡萄酒原料中的前体物质产生4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP）和4-乙基愈创木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG），低浓度下增加葡萄酒香气的复杂性，高浓度下产生典型的“马厩味”不良风味，降低葡萄酒的香气和口感，影响葡萄酒的经济价值。本文通过对比适用于葡萄酒厂的去除酒香酵母污染、避免不良风味产生的不同方法，发现使用抑制酒香酵母多糖以及合理控制葡萄酒中游离二氧化硫含量，可以有效的降低葡萄酒中酒香酵母的含量，降低其对葡萄酒风味的影响。

关键词：葡萄酒；酒香酵母；不良风味；防控

酒香酵母是葡萄酒厂常见的微生物污染之一，最早在啤酒中被发现，现在已知其广泛存在于啤酒、葡萄酒以及各种果汁饮料中［1］。目前酒香酵母主要有以下几个种：Brettanomyces custersianus，Brettanomyces naardenensis，Brettanomyces nanus，Brettanomyces anomalus和Brettanomyces bruxellensis［2］。酒香酵母产生的糖苷酶可以将葡萄浆中的结合态糖苷键形式风味前体化合物分解，释放出具有挥发性香气的物质，在增加葡萄酒香气的复杂性的同时，产生的4-乙基苯酚（4-PE）、4-乙基愈创木酚（4-EG）具有马厩味、鼠尿味、皮革味、医药味等令人不愉悦的气味［3］。这些香气共同作用，形成了酒香酵母属的风味特征［4］。当4-EP与4-PG的含量分别超过605 μg/mL和100 μg/mL时将被人察觉到，表现为创可贴、鼠尿、马汗等不良风味，降低葡萄酒带来的感官享受，引起消费者的抗拒，从而造成酒厂的经济损失。

酒香酵母在葡萄酒厂存在较为广泛：葡萄园中以及生产车间的空气、墙面、地面、储酒容器、橡木桶、酿造设备和葡萄酒等，均有可能感染酒香酵母。尤其以橡木桶最易感染酒香酵母，因为橡木桶内壁不规则的表面上有供其代谢的二糖或纤维二糖，可以为酒香酵母提供理想的生长环境。

目前酒香酵母已经引起了国际葡萄酒行业的极大关注，国外众多高校以及研究单位都对其进行了的研究。2014年曹培鑫等［1］对部分酒厂取样检测的结果表明，部分产区的葡萄酒中存在酒香酵母污染，应引起酒厂足够的关注。

酒香酵母对环境有着较强的耐受能力，使葡萄酒厂对酒香酵母的防控存在困难。有研究表明：大约25%的酒香酵母可在以乙醇为唯一碳源的环境下生长，约10%左右的菌株可在可溶性淀粉中生长［5］。大多数酒香酵母可将硝酸盐作为唯一氮源生长。同时酒香酵母有着较高的酒精适应能力，可以耐受高达14%～14.5%的酒精度。酒香酵母在pH2.5的条件下可以生长，其中94%的菌株在pH2.0时仍可生长。有1/3的酒香酵母属菌株可以在37 ℃以上的环境中生长，1/3左右的菌株可以在低于10 ℃的环境中生长繁殖。本文针对酒香酵母的特征，结合葡萄酒厂的实际情况，采用生物学方法、物理学方法以及化学方法对赤霞珠干红葡萄原酒中酒香酵母防治方法进行了对比分析研究，寻找适于葡萄酒厂生产实践使用的，可以显著降低葡萄酒中酒香酵母含量及产生不良风味的风险的方法。

1　材料与方法

1.1材料

赤霞珠干红葡萄原酒，抑酒香酵母多糖STAB MICRO，灭菌具塞三角瓶，焦亚硫酸钾，NaCa皂土，0.45 μm滤膜，WLN培养基，PALL无菌过滤系统，PALL错流过滤机，恒温培养箱。

1.2方法

取同一有酒香酵母检出的葡萄酒作为试验用酒，分别采用生物学方法（抑酒香酵母多糖）、物理学方法（澄清过滤法）以及化学方法（SO2杀菌法）处理葡萄酒。用灭菌三角瓶取100 mL处理后的酒液，离心收集菌体，用1 mL无菌水悬浮菌体，涂布于WLN筛选培养基上，28 ℃培养1周左右。酒香酵母在WLN培养基上菌落形态为扁平、表面光滑不透明、黄油状、中间绿色边缘奶油色的半圆形菌落，菌落计数并分离单菌落。通过对比不同方法处理后酒液中酒香酵母含量的变化情况，比较其除菌效果。

1.2.1生物学方法除菌

抑酒香酵母多糖是一种从黑曲霉中提取出的天然多糖，可以特异性地结合酵母的细胞壁，从而达到抑制酒香酵母的作用。本试验按照0 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L的浓度梯度向试验用酒中添加抑酒香酵母多糖。具体方法为：按照浓度梯度及所用原酒的数量准确计算称取所需抑酒香酵母多糖重量，按照1︰20的比例将其预溶解至原酒中，轻轻搅拌，避免结块；搅拌均匀后将其缓慢添加至待处理原酒中，搅拌30 min，静置，分别于3 d，6 d，10 d取样检测酒香酵母含量。采用WLN培养基筛选法检测酒香酵母的含量。

1.2.2物理方法除菌

葡萄酒工厂常用的物理除菌方法有澄清处理、离心处理及膜过滤等。将试验用基酒做如下处理：

（1）对照组：原酒存放于储酒容器中，不经过任何处理；

（2）NaCa皂土澄清处理：根据待处理原酒的数量，按照0.5 g/L的工作浓度准确称取NaCa皂土，用软化水配制成浓度为5%（w/v）的溶液，静置膨胀24 h，搅拌使其形成均匀的悬浊液后添加至原酒中，澄清7 d后分离清酒，用WLN鉴别培养基检测处理后原酒中酒香酵母含量；

（3）按照0.5 g/L工作浓度的NaCa皂土溶液处理原酒，澄清7 d后分离清酒，用PALL错流过滤机对清酒进行错流过滤；

（4）直接将葡萄酒进行错流过滤，每处理3个重复，处理后分别取酒样检测酒香酵母含量。检测酒香酵母采用WLN培养基筛选法。

1.2.3化学方法除菌

SO2在葡萄酒生产过程中起着重要的作用［6］。合理使用有利于控制葡萄酒中微生物的活动，净化发酵基质，抗氧化等。使用不当或浓度过高可能会造成葡萄酒脱色、产生不良风味，对人产生毒害。首先检测试验用原酒初始FSO2（游离态SO2）含量，本试验通过调整葡萄酒中的FSO2含量至20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L，研究其对酒香酵母的控制效果以及对葡萄酒品质的影响。

2　结果与分析

2.1生物学方法除菌效果分析

葡萄酒经过不同浓度梯度的抑酒香酵母多糖处理后，所含酒香酵母的数量见表1。用量为0.1 g/L时即可以显著地去除酒中的酒香酵母，3 d后能将酒香酵母含量降至较低的数值，10 d后可完全去除酒香酵母；用量增加至0.2 g/L时，6 d即可将葡萄酒中酒香酵母几乎全部去除。

2.2物理方法除菌效果分析

三种物理除菌方法操作难易程度及除菌效果见表2。由表2可以看出，皂土处理可以降低原酒中酒香酵母含量，澄清处理后进行错流过滤和直接过滤两种方法可以将酒中的酒香酵母降至极低的水平，但直接过滤耗时长，成本高。与此同时，3种处理方法均可以提升原酒香气的纯净度、优雅性并使酒体澄清，但葡萄酒颜色稍有损失。

综合比较上述3种物理方法的除酒香酵母效果，对原酒感官品质的影响及操作难易程度，澄清处理后进行错流过滤的方法可以有效的降低酒香酵母含量，并且过滤容易，成本低。

2.3化学方法除菌效果分析

SO2可以降低酒中酒香酵母的含量。调节FSO2含量至20 mg/L时，酒香酵母进入休眠状态，随着时间推移，FSO2含量降低，酒香酵母继续繁殖［7］。而FSO2含量过高则会降低葡萄酒的感官品质。由从表3可以得出，FSO2含量维持在30 mg/L左右可以起到控制酒香酵母的作用，且对葡萄酒感官品质影响较小。

表1　不同抑酒香酵母多糖加量及处理时间对酒香酵母含量的影响

表2　不同物理方法去除酒香酵母效果对比

表3　不同FSO2浓度处理效果对比

3　讨论与结论

酒香酵母问题困扰着很多葡萄酒生产企业，如何对其进行有效的防治并使其对葡萄酒品质影响最小化是亟待解决的技术难题。本试验对比了生物学方法（抑酒香酵母多糖）、物理学方法（澄清过滤法）以及化学方法（SO2杀菌法）3种不同处理方式去除葡萄酒中酒香酵母的效果，结果表明：抑酒香酵母多糖可以有效的降低葡萄酒中酒香酵母的含量，减少葡萄酒中酒香酵母属不良风味的产生，对葡萄酒感官品质无不良的影响。

Millet等［8］研究表明，过滤可将葡萄酒中微生物的含量降低1000倍左右，但不能除去处于休眠状态的芽孢。休眠芽孢一旦遇到适宜的环境可能再次繁殖，对葡萄酒风味造成不良影响。本文对比的三种物理学除菌方法中皂土处理后再进行错流过滤的方法也可以有效的控制酒香酵母含量，提升香气洁净度，同时造成葡萄酒颜色的损失，不适于单纯用于去除酒香酵母污染。

通过调节葡萄酒中FSO2的含量来控制葡萄酒中的微生物生长繁殖是葡萄酒厂常用的方式之一，将葡萄酒中FSO2的含量保持在30 mg/L左右有利于酒香酵母的防控。

综上所述，用抑制酒香酵母多糖处理葡萄酒和合理控制葡萄酒中FSO2的含量两种方法可以达到防控酒香酵母的目的。

参考文献

［1］ 曹培鑫, 马涛, 杨凯迪, 等. 我国葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母的检测和鉴定［J］. 食品科学, 2015, 36（23）： 172-177.

［2］ OELOFSE A, PRETORIUS I S，TOIT M D. Significance of Brettanomyces and Dekkera during winemaking： A synoptic review［J］. S Afr J Enol Vitic, 2008, 29（2）： 128-144.

［3］ 葛有辉, 王德良, 曹健. 富含β-葡萄糖苷酶的酒香酵母在酿酒领域中的应用［J］. 酿酒科技, 2011（2）： 96-99.

［4］ STAPLES E J. Monitoring Brettanomyces in wine aroma with an electronic nose［EB/OL］. http：//www.QASolutionInC.com/ TechPapers/Brett_in_Wine.pdf, 2010.

［5］ 林文华, 游雪燕, 冯涛. 葡萄酒酒香酵母属不良风味抑制的研究进展［J］. 中国酿造, 2013, 3（5）： 5-9.

［6］ 李华. 现代葡萄酒工艺学［M］. 西安： 陕西人民出版社, 2000：131-133.

［7］ AGNOLICCI M，REA F. Sulphur dioxide affects culturability and volatile phenol production by Brettanomyces/Dekkera bruxellensis［J］. Int J Food Microbiol, 2010, 143（1-2）： 76-80.

［8］ MILLET V, LONVAUD-FUNEL A. The viable but non-cultrable state of wine microorganisms during storage［J］. Letters in Applied Microbiology, 2000, 30（2）： 136-141.

新型薄膜过滤器可保持葡萄酒香气

在加拿大不列颠哥伦比亚省，曾经作为肺科教授的Dick Jones正在研究使白葡萄酒气味变佳的方法。他已经找到了保持芳香化合物的有效方法，可防止发酵过程中的损失，当地酒厂对研究结果给予关注。Jones将该设备称作“AromaLoc”，是一个薄膜过滤器，希望明年能够获得专利并上市销售。

Jones出生在美国，1971年搬到加拿大阿尔伯塔（Alberta），在阿尔伯塔大学从事肺科教学35年。2005年，Jones和妻子搬到加拿大奥克纳根山谷的纳拉马塔，不久之后便开始利用灰皮诺和佳美葡萄进行酿酒。

他非常喜欢葡萄酒的香气。但他发现，当品尝成品葡萄酒时，很多香味都消失了。很多葡萄酒酿酒商一直在保持芳香物质方面做努力，例如酿酒过程中采用冷发酵法或反渗透法，但方法都不太有效。

2012年，Jones读到了一篇新型膜研发的报道。挪威科技大学（Norwegian University）化学工程师May-Britt H☒gg研发出一种膜，用于除去燃煤电厂排放的CO2。随后，他与H☒gg联系将发明用于葡萄酒，H☒gg对此非常感兴趣。

Jones改进并测试了装置，它看起来非常简单，像一块平板，有光泽，其实上面附有无数个人眼看不见的微小膜片，比单个红细胞还要薄。在进行葡萄酒发酵时，这些膜片允许CO2通过，但芳香物质等大分子物质则不能通过。Jones把这归功于他的肺科学知识：人体肺部的设计就是释放CO2，把其他物质留在其中。

2015年，Jones与潘塔治酒庄（Pentage Winery）庄主Paul Gardner将该设备第一次用于商业生产，利用1000 L发酵罐酿造了700 L灰皮诺葡萄酒。罐顶代替常用的塑料薄膜封闭，改用18英寸长的橡胶管连接，橡胶管内部布有无数薄膜片，看起来像个行李箱。

然后，葡萄酒样品送到哥伦比亚大学的葡萄酒研究中心（University of British Columbia's Wine Research Centre）进行芳香化合物分析。结果显示，该葡萄酒中芳香物质比其他正常葡萄酒含量高出很多。另一位小组成员Alison Moyes说：“起初我也表示怀疑，但葡萄酒中的芳香物质含量差别太明显了。”

现在AromaLoc专利正在申请，该装置将于2017年作为商品提供。

来源：http：//www.winespectator.com/（李旋编译）

Contrast of three methods to remove the effect of Brettanomyces from wine

FU Xiaofang1, WANG Huanxiang1, SHANG Hua1, BAI Youbo1, ZHU Ya'nan1, GAO Chengjun1, ZHAO Xiaoning1, WANG Shengjie2
（1. China Great Wall Wine Co., Ltd. Huailai, Hebei, 075400； 2. COFCO Great Wall Wine （Zhuolu） Co., Ltd. Zhuolu, Hebei, 075600）

Abstract：Brettanomyces is one of the main microbial contamination in winery. They were often been found in the space, equipments and wine. In the fermentation process, Brettanomyces can take advantage of precursor in wine to produce 4-Ethylphenol（ 4-EP） and 4-Ethylguaiacol（4-EG）. At low concentrations those two materials can increase the complexity of wine, while at high concentration give bad taste and disagreeable flavors, and reduce the economic value. By comparison three methods of Brettanomyces control, the result showed that using STAB MICRO and reasonable concentration of free SO2would be effective at reducing the impact of Brettanomyces on wine flavor.

Key words：wine； Brettanomyces； disagreeable flavors； control

中图分类号：TS262.6

文献标识码：A

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.03.004

收稿日期：2016-03-03

基金项目：河北省现代农业科技奖励性后补助资金项目（15927116H）

作者简介：傅晓方（1985-），女，硕士研究生，工程师，研究方向：葡萄酒酿造。E-mail： fxfmbe@163.com