香菇母种组织分离控制褐变的实验研究

臧玉红

(承德石油高等专科学校 化学工程系,河北　承德　067000)



香菇母种组织分离控制褐变的实验研究

臧玉红

(承德石油高等专科学校 化学工程系,河北承德067000)

摘要：为降低香菇母种组织培养过程中外植体的褐变程度，从菌块的大小、菌种的表面消毒时间、培养基的新鲜程度、培养基中活性炭及琼脂的含量进行综合实验。结果表明：菌块大小选择在0.5～0.9 cm2，升汞消毒时间保持在3～5 min,使用活性炭含量为0.2%～0.4%，琼脂含量为2.0%～4.0%，新鲜度为4 d内的培养基，能有效地控制褐变，并使菌丝生长健壮。

关键词：香菇；褐变；组织分离

香菇享有“菇中皇后”等美称[1]，随着人们对香菇营养价值和保健功能的认识，栽培面积不断扩大，培养过程中褐变等问题也凸显出来，直接制约着香菇业的发展[2-3]。褐变是指外植体在培养过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步褐变而死亡的现象。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐色，而且对许多酶也有抑制作用。香菇组织分离培养过程中，组织块褐变现象严重，前期影响菌丝生长，后期将培养基染成褐色，从而影响母种分离成功率和质量[4-5]。本实验利用香菇菌柄、菌盖交接处的组织作为外植体，从接种组织块大小、消毒时间、培养条件等方面，研究物理和化学因素对香菇离体培养中外植体褐化的影响，以期将褐变控制在最低程度，提高离体快繁效率，为香菇工厂化育苗奠定技术基础。

1材料与方法

1.1实验材料

香菇(品种939)，食用菌生产大棚采摘；琼脂、活性炭等化工商店采购，分析纯。

1.2实验仪器

超净工作台、培养箱、高压灭菌锅、微生物培养室、试管、三角瓶等。

1.3实验设计

1.3.1接种组织块大小对褐变的影响

分别选用0.1 cm3、0.3 cm3、0.5 cm3、0.7 cm3、0.9 cm3、1.1 cm3六种不同大小的组织块进行接种，每种组织块接种试管20支试管，每支两粒，观察记录组织块变化及菌丝生长状况。

1.3.2接种组织块消毒时间对褐变的影响

在无菌操作台上用75%乙醇溶液擦拭消毒后，再分别用0．1%升汞浸泡1、3、5、7、9、11 min，再用无菌水冲洗3～4次，接种于培养基上培养，每种处理接种20支试管，每瓶接种两粒，培养观察。

1.3.3培养基放置不同时间(表面含水量不同)对褐变的影响

分别将0.6 cm3处理好的组织块接种不同新鲜度的培养基上。培养基分别放置0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d，然后接种香菇组织块，每个处理20支，每支接两粒，培养观察记录组织块、培养基变化及菌丝生长情况。

1.3.4培养基中活性炭添加量对褐变的影响

在培养基上分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的活性炭作为吸附剂，每个处理接种20支，每支接两粒，培养观察记录结果。

1.3.5培养基加入琼脂量对褐变的影响

在配制培养基时加入不同浓度的琼脂，琼脂用量分别为5、10、15、20、25 g/L，每个处理接种20支，每支接两粒，培养观察、统计结果。

1.3.6在最佳条件下研究对褐变率的影响

通过上面实验结果，在最佳条件下设计实验，统计褐变率，验证实验结果。

1.4实验方法

1.4.1香菇的选择及消毒从食用菌生产棚采摘新鲜无破损、无虫害、成熟前期的香菇(品种为939)，表面用75%的酒精擦洗消毒备用。

1.4.2培养基的制备 基础培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL)，pH自然。常规方法制备试管斜面培养基。

1.4.3香菇组织块的接种与培养。在超净工作台上严格按照无菌操作规程接种。把接种好的试管，做好标记，摆放到培养架上置于25 ℃、暗光条件下培养，每天观察记录，持续40 d。

1.5数据处理

1.5.1褐变率的计算

褐变率=褐变个数/接种个数×100%

1.5.2实验数据采用Excel和SPSS 1.7进行分析处理[6]。

2结果与分析

2.1接种组织块大小对香菇组织培养过程中褐变的影响

选用大小不同的组织块接种到基础培养基上培养，观察记录的结果见表1。

通过表1分析可知，随着菌块的增大，褐变率明显下降，菌块越小，褐变率越高，0.1 cm2的菌块褐变率达到51.95%，褐变数一半以上。小于0.3 cm2以下的菌块，褐变率高可能是菌块较小，切割面积大，与外界接触面积就大，褐变的几率随之增加，菌块太小很难长出菌丝，同时长出的菌丝生长非常缓慢，所以菌块太小不适合接种；另外，当菌块达到1.1 cm2时，菌块增大，消毒不容易彻底，褐变率降低1%，降幅不明显，所以接种菌块以0.5～0.9 cm2较好。

表1　组织块大小对褐变及菌丝生长情况的影响

注：同一列数据后不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)，下同。

2.2消毒时间对香菇组织培养中褐变的影响

将0.6 cm2大小的新鲜菌块进行不同时间的消毒，然后进行培养，所得结果如表2。

表2　消毒时间对褐变及菌丝生长情况的影响

表2的数据分析可知，随着升汞消毒时间的增加，褐变率逐渐增加，当消毒时间为1 min时，褐变率最低为12.5%，但菌快污染率较高，菌丝生长受影响；当消毒时间为11 min时，褐变率可高达到46.35%，且消毒时间大于9 min以上时，有可能对菌块表面的组织破坏，从而菌丝生长开始变得缓慢，综合考虑，消毒时间为3～5 min为宜。

2.3培养基新鲜度对香菇组织培养中褐变的影响

把接种到不同新鲜度培养基的菌种在培养箱中培养，结果如表3。

表3　培养基新鲜度对褐变及菌丝生长情况的影响

从表3数据分析可知，随着培养基新鲜度的下降，褐变率逐渐增加，从12.54%至30.53%，这可能是随着培养基放置时间的延长，一方面水分减少比较多，另一方面培养基本身也增大了污染性，从而使外植体菌快生长菌丝的时间推迟，褐变率提高。因此，用于接种的培养基以不超过4d的新鲜培养基为宜。

2.4培养基中活性炭对香菇组织培养中褐变的影响

在不同活性炭比例的培养基上接上菌种后培养，观察记录的结果如表4。

通过表4数据分析可知，随着培养基中活性炭百分比浓度的增加，褐变率逐渐下降，但是下降的幅度都比较小，下降10%左右，也就是说活性炭的加入量对褐变率影响较小。活性炭具有较强的吸附作用，可以吸附菌种产生的褐色有毒物质，减少有害物质对接种菌体的影响，从而降低褐化率。但是活性炭同时也吸附了培养基中的一些生长调节剂，随着活性炭浓度的加大不仅降低了菌丝的形成，还影响了菌丝的生长，所以活性炭的加入量应以加入少量为佳。

表4　活性炭对褐变及菌丝生长情况的影响

2.5培养基中琼脂对香菇组织培养中褐变的影响

在不同琼脂比例的培养基上接种菌种后培养，观察记录的结果如表5。

表5　琼脂含量对褐变率的影响

由表5可知，培养基中含琼脂的多少，直接影响培养基的硬度，也就影响香菇组织培养的褐变率。使用0.5%、1.0%的琼脂，培养基硬度小，基本上呈半固体培养基，尤其是当含有0.5%的琼脂时，接种后，菌块淹没进入培养基中，褐变率高达60.33%，且菌丝生长较少。随着加大琼脂的用量，增加了培养基的硬度，褐变率也随之减轻。当培养基中琼脂用量为3.0%时，褐变率达到最低值17.55%．随着培养基硬度进一步加大，褐化率又出现上升趋势，褐化多产生于培养基接触的部位,这可能是由于硬度过大，阻碍了菌种外渗的有毒褐色物质的扩散，造成有毒物质的局部累积，从而加大了褐化程度。琼脂仅仅是起到影响培养基硬度的作用，而不给菌种提供营养等，琼脂的含量多少对菌丝的生长状况影响较少，所以，琼脂的用量主要考虑褐变率，应该在2.0%～4.0%较好。

2.6验证实验结果

在最佳实验条件下接种培养，统计褐变率结果如表6。

表6　最佳条件下对褐变率及菌丝生长情况的影响

由表6可知，在较优的培养条件下，褐变率得到有效的控制，降低到8%，并且菌丝生长良好，可见本课题的结果有较强的实践指导性。

3结论

食用菌组织培养过程中引起褐变的因素是复杂的，随种类、基因型、外植体部位等的不同，褐化程度也有所不同。本实验从菌块大小、消毒时间、培养基添加剂等5个方面对香菇离体培养中外植体褐化的影响进行了研究，使褐变率控制在8%较低的程度，降低了生产成本，为香菇快繁提供了可靠的实验数据。

参考文献：

[1]万伏红,谢经荣,雍松林.香菇营养价值丰富具有广泛的市场前景[J]．农村实用技术，2013(4):53.

[2]冀宝赢.北方反季节地栽香菇栽培技术研究[J].中国食用菌，2014(4)：67-69.

[3]班新河,魏银初,王震，等.香菇栽培集成新技术在生产中的应用[J].食用菌，2014，36(3):38-40.

[4]刘玲玲.植物组织培养中外植体发生褐变的原因及防止措施[J].喀什师范学院学报,2011,32(3):44-47.

[5]彭丽萍,郜海莲.防止软籽石榴外植体褐变的研究[J].安徽科技学院学报,2011,25(2):28-31.

[6]唐世星,毛玉强,杨光.Mathematica在高等数学实验中的应用[J].承德石油高等专科学校学报,2014(5):48-50.

Browning Control of Mother Species in Tissue Separation of Lentinus Edodes

ZANG Yu-hong

(Department of Chemical Engineering, Chengde Petroleum College, Chengde 067000, Hebei, China)

Abstract:Edible fungus block size, sterilization time of edible fungus surface, freshness of culture medium, the content of activated carbon and agar in culture medium were comprehensive studied for reducing the browning rate of explants mother species in tissue culture of shiitake mushrooms. The results showed that the browning rate control and mycelial growth were best when bacteria block size was between 0.5～0.9 cm2, the explants were sterilized by 0.1% mercury solution for 3～5 min, the content of activated carbon in culture medium was 0.2%～0.4%, the content of agar in culture medium was 2.0%～4.0%, and freshness of medium was within 4 days.

Key words:lentinus edodes; browning; tissue separation

基金项目：河北省科技支撑计划项目(废弃菇渣在蔬菜无土栽培中的配方研究及栽培模式的建立)：12227304

收稿日期：2015-10-19

作者简介：臧玉红(1968-)，女，河北保定人，承德石油高等专科学校化学工程系副教授，硕士，从事生物技术、生物化工、微生物等方面的教学科研工作。

中图分类号：S646

文献标识码：A

文章编号：1008-9446(2016)02-0013-04