正庚烷代替二甲苯在拟南芥花药石蜡切片中的应用

涂磊 张丽瑶

（武汉大学生命科学学院，武汉 430000）

正庚烷代替二甲苯在拟南芥花药石蜡切片中的应用

涂磊 张丽瑶

（武汉大学生命科学学院，武汉 430000）

二甲苯是应用最广的一种透明剂，常用于石蜡切片中的脱蜡和透明，但由于其对人体危害大，广大科研工作者一直在探寻更加安全的二甲苯代替物。以不同时期的拟南芥花药为试材，脱蜡和透明均由正庚烷代替二甲苯完成，其余步骤与常规石蜡切片相同。结果显示，正庚烷透明力强而迅速，既能与乙醇、封藏树胶混合，又能溶解石蜡，可作为合适的透明剂和脱蜡剂；组织经正庚烷处理后物理性质良好，浸蜡充分，切片时软硬适中，容易连续切片，而且厚薄均匀，摊片时能在42℃水中自然展开，平整而无皱褶；经甲苯胺蓝染色，细胞着色好，核质分明，结构清晰，组织形态保持完好，与二甲苯作透明剂的切片效果无明显区别。因此，正庚烷可以作为一种新的、相对安全有效的二甲苯替代物，应用于植物组织切片中。

正庚烷；二甲苯；石蜡切片；透明剂

制片技术是生物学工作者常用的一门实验技术，它是从事动植物生物技术、细胞生物学、结构植物学、植物生殖生物学、植物发育生物学等研究的必要技术基础，在生物科学领域占有重要地位。

石蜡切片法是组织学、发育生物学研究最常用的制片技术之一，广泛运用于临床病理诊断、教学和科研工作中。常规的石蜡切片制作过程是：取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→染色→脱蜡→封片。传统使用的透明剂和脱蜡剂是二甲苯［1，2］，二甲苯是一种有芳香气味的刺激性、易挥发液体，有毒性，主要对中枢神经和植物神经有麻痹和黏膜刺激作用，是一种潜在的致癌物质。大量的动物实验研究表明，过多接触二甲苯会引起神经系统、肝脏、肺、皮肤等多个组织的毒性反应［3-7］。二甲苯的细胞学毒性主要体现在诱导线粒体解偶联和氧化应激反应［8］。接触和使用化学试剂的安全性可以从http://www.proscitech.com/网站上查询物质安全资料表（MSDS）得到。

由于二甲苯对人体危害大，广大科研工作者一直致力于寻找更加安全的二甲苯代替物。1978年，Maxwell曾提出可使用三氯乙烷作为透明剂，此后便有越来越多的技术人员使用该替代物［9］，但由于三氯乙烷的蒸气仍然有毒，因此在实验过程中必须保持良好的通风状态［10］。此后，多种二甲苯替代物，例如：植物油［11］、葵酸丁酯［12］、异丙醇［13］、异丙醇-矿物油混合物［14］、丙二醇甲酯［15］、辛烷［16，17］、硬脂酸［18］、松节油［19］、环保透明剂［20］、Y透明剂［21］、甲基环己烷［22］等被相继使用。

正庚烷是一种脂肪族烃化合物，无色易挥发液体，不溶于水，溶于醇，可混溶于乙醚、氯仿，熔点-90.5℃，沸点98.5℃，易燃，为汽油的组成成分之一，主要用作测定辛烷值的标准物［23］。此前，已有研究者将正庚烷作为二甲苯的替代物，用于动物组织切片的透明和脱蜡过程，并取得良好效果［24］。但正庚烷是否同样适用于植物组织切片，尚无人研究。本实验室多年来一直致力于被子植物受精与胚胎发生的研究，组织切片是本实验室研究的必要基础技术。本研究以拟南芥不同发育时期的花药切片为例，探究正庚烷替代二甲苯用于植物组织切片的可能性，拟为植物研究工作者提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 野生型拟南芥（COL）温室种植（22℃，16 h光照/8 h黑暗）长至开花期，取新鲜花序进行后续实验。

1.1.2 试剂 FAA固定液（福尔马林5 mL，乙酸5 mL，50%乙醇90 mL），现配现用；无水乙醇，配成不同浓度备用；正庚烷（国药）；石蜡（Sigma）；多聚赖氨酸：粉末购自Sigma公司，称取20 mg多聚赖氨酸粉末溶于20 mL去离子水中，配成10×母液，-20℃保存；甲苯胺蓝染色液：粉末购自Sigma公司，称取1 g甲苯胺蓝粉末，溶于100 mL 70%乙醇中，4℃保存，使用时以双蒸水100倍稀释；加拿大树胶（Sigma）。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机（AO），恒温加热仪（瑞华），磨刀机（Leica SP9000），光学显微镜（OLYMPUS IX71）。

1.2 方法

1.2.1 处理载玻片 用1%-2%盐酸乙醇（95%医用乙醇100 mL中加入浓盐酸1-2 mL）浸泡过夜→流水冲洗（放在塑料篮中）→取出后放入95%（医用）乙醇中备用。使用前擦干载玻片，均匀涂抹多聚赖氨酸水溶液，置于60℃烘箱烘1-2 h干燥。

1.2.2 固定 取新鲜的拟南芥花序，放入20 mL小瓶中，加满FAA固定液，抽真空辅助固定20-30 min，更换固定液后，4℃冰箱放置过夜。

1.2.3 脱水 50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇逐级脱水，材料在无水乙醇中脱水30 min，其他各级分别脱水1 h，最后一级脱水需更换2次无水乙醇。

1.2.4 透明 1/2无水乙醇＋1/2正庚烷→纯正庚烷→纯正庚烷逐级浸泡材料，每级放置1.5 h。

1.2.5 浸蜡 提前融石蜡，弃上一级正庚烷，配置体积比为1∶1的正庚烷/纯石蜡混合液，于58℃恒温台浸泡材料过夜，之后使用纯石蜡替换上一级溶液，每隔12 h换一次纯石蜡溶液，共替换6次。

1.2.6 包埋 将充分浸蜡的材料倒入已叠整齐的纸盒中，石蜡凝固前摆正材料方向，待石蜡凝固后放入4℃冰箱保存备用。

1.2.7 切片 切片前磨刀→分割、修整蜡块呈梯形→固定蜡块→固定切片刀，调节刀的角度到15°→调节切片厚度使其为10 μm→调节刀口与蜡块的距离、蜡块的位置→切片。

1.2.8 展片、粘片 将蜡带置于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，加蒸馏水展平蜡带后于42℃展片台上烤干。

1.2.9 染色 将玻片放入染缸，再将甲苯胺蓝染液加入染缸至淹没玻片，染色10 min，再用双蒸水清洗玻片，42℃烘箱中烘干。

1.2.10 脱蜡及封片 正庚烷浸泡玻片2次，每次10 min，取出玻片滴加加拿大树胶，盖上盖玻片封片。

2 结果

2.1 正庚烷代替二甲苯作透明剂

材料经固定及各级乙醇脱水后，再用正庚烷逐步透明。结果（图1，图2）显示，处理后的组织呈半透明状态，且能保持平整，无收缩、变形现象；浸蜡后切片，容易连续切片而且厚薄均匀，摊片时能在42℃水中自然展开，平整而无皱褶，说明以正庚烷作透明剂，不仅能与脱水剂充分混合，又能被石蜡完全取代，透明效果好，是一种合适的透明剂。

2.2 正庚烷代替二甲苯作脱蜡剂

展片、烘片、染色以后，用正庚烷浸泡玻片2次，每次10 min。结果（图3）显示，仅剩下植物组织仍保持在原位，用于支撑组织和细胞的石蜡已被完全溶解，组织、细胞更加透明清晰，便于观察；用正庚烷溶去组织内外的石蜡只需要20 min，脱蜡快而干净，表明正庚烷是一种合适的脱蜡剂。

图1 正庚烷透明拟南芥花序

图2 正庚烷透明拟南芥不同时期的花

图3 正庚烷脱蜡效果

2.3 光学显微镜下花药形态的观察

脱蜡后的组织经封藏剂封藏后，便可以长期保存，显微镜下观察切片，结果（图4）显示，甲苯胺蓝染色颜色鲜亮，细胞着色好，核质分明，结构清晰，组织形态保持完好，能达到以二甲苯作透明剂的石蜡切片效果。

3 讨论

在组织制片实验中，透明和脱蜡是两个十分重要的步骤，透明是脱水与浸蜡、脱水与封藏之间的桥梁，而切片后需要用脱蜡剂溶去组织和细胞内外的石蜡，才能使细胞、组织更加透明清晰，便于观察。传统使用的透明和脱蜡试剂是二甲苯，二甲苯是含苯环的芳香族化合物，毒性高，虽然已有各种二甲苯替代物被开发使用，但是却未普及：或因效果不稳定，或因价格较高［25］，因此，新的、更加安全有效的二甲苯替代物亟待研发。

图4 发育前期（A）及后期（B）的拟南芥花药

二甲苯具有慢性毒性，经常或反复侵入人体后会引起神经衰弱、植物神经紊乱或皮肤黏膜刺激等症状，具体如头痛、头晕、乏力、睡眠障碍、血压降低、轻度贫血、皮炎等表现［26］。对妊娠期妇女还会导致妊娠贫血、妊娠高血压综合征、自然流产等症状，对月经机能、生殖机能和子代发育有一定的影响和损害［27］。另有文献报道，苯类化合物在一定程度上会引发牙周组织疾病［28］。而正庚烷只是对直接接触的皮肤有轻度刺激性，并具有麻醉作用。国家标准职业性接触毒物危害程度分级，将二甲苯定为III级（中度危害），溶剂汽油（正庚烷为其组成成分之一）为IV级（轻度危害）［29］。

正庚烷是短链脂肪烃化合物，相比于芳香烃二甲苯，正庚烷与石蜡结构更为相似，溶解石蜡也更加迅速。常规二甲苯脱蜡时间为每次20 min，正庚烷脱蜡时间为每次10 min，脱蜡快而干净。以正庚烷为透明剂，透明效果好，处理后的材料呈半透明状，后续浸蜡充分，容易连续切片，不脱片，摊片时能在42℃水中自然展开，平整而无皱褶。本实验研究发现，经正庚烷处理后的组织染色效果好，甲苯胺蓝染色10 min即可，颜色鲜亮，核质分明，结构清晰，解决了植物油等二甲苯替代物染色不佳的问题。

在实验中，应用正庚烷需要注意的是：正庚烷易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，应远离火种，密封、避光保存；有一定的挥发性，用完及时盖严。为了脱水彻底并使材料减少收缩，透明时可逐步从纯乙醇过渡到正庚烷，即1/2无水乙醇＋1/2正庚烷→纯正庚烷→纯正庚烷（正庚烷应更换2次，以除尽乙醇）。

正庚烷作为一种新的、相对安全有效的二甲苯替代物，有望在植物组织切片中普及使用。拟南芥是植物研究的模式植物之一，花药是植物生殖生物学的重要研究对象。本研究成功地将正庚烷应用于拟南芥花药石蜡切片实验，下一步应选取更多种类的植物材料及更多样化的组织开展实验，以期将正庚烷普遍应用于植物制片技术，消除二甲苯对制片人员的危害，改善工作环境。

4 结论

本研究对拟南芥不同时期的花药进行石蜡切片，通过使用正庚烷作为透明剂和脱蜡剂，消除了传统透明试剂二甲苯对实验人员的危害。用正庚烷处理材料，透明效果好，浸蜡充分，容易连续切片，脱蜡快速且干净，染色佳，组织结构保持完整。因此，正庚烷可以作为一种新的、相对安全有效的二甲苯代替物，应用于植物组织切片中。

［1］Matthews JB. Influence of clearing agent on immunehistochemical staining of paraffin-embedded tissue［J］. Clinical Pathology, 1981, 34（1）：103-105.

［2］Pollard K, Lunny D, Holgate CS, et al. Fixation, processing, and immunochemical reagent effects on preservation of T-lymphocyte surface membrane antigens in paraffin-embedded tissue［J］. Histochemistry and Cytochemistry, 1987, 35（11）：1329-1338.

［3］Gamberale F, Annwall G, Hultengren M. Exposure to xylene andethylbenzene. III. Effects on central nervous functions［J］. Work, Environment & Health, 1978, 4（3）：204-211.

［4］Hass U, Lund SP, Simonsen K, et al. Effects of prenatal exposure to xylene on postnatal development and behavior in rats［J］. Neurotoxicol Teratol, 1995, 17（3）：341-349.

［5］Kum C, Kiral F, Sekkin S, et al. Effects of xylene and formaldehyde inhalations on oxidative stress in adult and developing rats livers［J］. Experimental Animals, 2007, 56（1）：35-42.

［6］Chatterjee A, Babu RJ, Ahaghotu E, et al. The effect of occlusive and unocclusive exposure to xylene and benzene on skin irritation and molecular responses in hairless rats［J］. Archives of Toxicology, 2005, 79（5）：294-301.

［7］Sandikci M, Seyrek K, Aksit H, et al. Inhalation of formaldehyde and xylene induces apoptotic cell death in the lung tissue［J］. Toxicology and Industrial Health, 2009, 25（7）：455-461.

［8］Revilla AS, Pestana CR, Pardo-Andreu GL, et al. Potential toxicity of toluene and xylene evoked by mitochondrial uncoupling［J］. Toxicology in Vitro, 2007, 21（5）：782-788.

［9］Temel SG, Noyan S, Cavusoglu I, et al. A simple and rapid microwave-assisted hematoxylin and eosin staining method using 1, 1, 1 trichloroethane as a de-waxing and a clearing agent［J］. Biotechnic & Histochemistry, 2005, 80（3-4）：123-132.

［10］Reid KJ, Young FJ. Are trichloroethane-based substitutes safer than xylene?［J］. Med Lab Sci, 1981, 38（2）：145-149.

［11］Bruun Rasmussen B, Norring Hjort K, Mellerup I, et al. Vegetable oils instead of xylene in tissue processing［J］. Apmis, 1992, 100（9）：827-831.

［12］Lyon H, Holm I, Prent P, et al. Non-hazardous organic solvents in the paraffi n-embedding technique：a rational approach［J］. Histochemistry and Cell Biology, 1995, 103（4）：263- 269.

［13］Viktorov IV, Proshin SS. Use of isopropyl alcohol in histological assays：dehydration of tissue, embedding into paraffin, and processing of paraffin sections［J］. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2003, 136（1）：105-106.

［14］Buesa RJ, Peshkov MV. Histology without xylene［J］. Annals of Diagnostic Pathology, 2009, 13（4）：246-256.

［15］Chen CY, He T, Mao XL, et al. A novel xylene substitute for histotechnology and histochemistry［J］. Biotechnic & Histochemistry, 2010, 85（4）：231-240.

［16］Fredricks DN, Relman DA. Paraffin removal from tissue sections for digestion and PCR analysis［J］. Biotechniques, 1999, 26（2）：198-200.

［17］Xing M, Du Y, Wang X, et al. A simplified paraffin embedding method for small botanical samples［J］. Biotechnic & Histochemistry, 2010, 85（4）：241-246.

［18］魏永敬, 汪兆亮. 硬脂酸代替二甲苯透明在石蜡切片中的应用［J］. 西南军医, 2007, 9（1）：57.

［19］李海鹤, 万明辉, 谭东海, 等. 松节油替代二甲苯在家禽组织制片中的应用［J］. 中国家禽, 2013, 35（19）：51-52.

［20］兰淼, 李艳红, 巩俐, 等. 环保透明剂替代二甲苯在病理制片技术中的应用［J］. 陕西医学杂志, 2012, 41（10）：1306-1307.

［21］孙帅, 赖洵. Y透明剂替代二甲苯在病理制片中的应用［J］.中国组织工程研究, 2012, 16（28）：5196-5199.

［22］王伟, 罗源. 一种针对人体皮肤组织快速、低毒的石蜡切片新方法［J］. 吉林医学, 2013, 34（30）：6211-6212.

［23］Windholz M. The merck index. An encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals［M］. 15th ed. Rahway：Royal Socirty of Chemistry, 2013.

［24］Stockert JC, López-Arias B, Castillo P, et al. Replacing xylene with n -heptane for paraffin embedding［J］. Biotechnic & Histochemistry, 2012, 87（7）：464-467.

［25］Piotrowska D, Długosz A, Pajak J. Antioxidative properties of coenzyme Q10 and vitamin E in exposure to xylene and gasoline and their mixture with methanol［J］. Acta Poloniae Pharmaceutica, 2002, 59（6）：427-432.

［26］李玲, 王文东, 栗学军, 等. 低浓度苯和甲苯及二甲苯对作业人员健康及血清中超氧化物歧化酶的影响［J］. 工业卫生和职业病, 2003, 29（4）：238.

［27］刘志敏, 王春华, 刘志勇, 等. 苯、甲苯和二甲苯作业女工对月经及生殖结局的影响［J］. 天津医学院学报, 1994, 18（3）：3-5.

［28］程金霞, 杜程悦. 苯类化合物与牙周组织疾病关系的研究［J］.职业与健康, 2001, 17（1）：8-9.

［29］ 中国预防医学科学院标准处. 劳动卫生国家标准汇编［G］.北京：中国标准出版社, 1992.

（责任编辑 马鑫）

Replacing Xylene with n-heptane for Paraffin Section of Arabidopsis thaliana Anther

TU Lei ZHANG Li-yao
（College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430000）

Xylene is widely used as clearing agent for dewaxing and clearing in paraffin section. However，due to its severe harm to human health，researchers have been seeking adequate substitutes. In this study，Arabidopsis thaliana anthers in various periods were processed with n-heptane replacing xylene as a novel clearing and deparaffinizing agent in paraffin section，and the rest of steps were the same as the conventional paraffin section. The results showed that n-heptane with strong and rapid transparency was able to be mixed with ethanol and gum and dissolve paraffin，thus could be utilized as clearing and dewaxing agent. The tissues processed with n-heptane was in fine physicchemical property and saturated with paraffin；due to the proper hardness of the section，continuously slicing was easy and slice thickness was uniform，moreover，the section was expanded naturally in the water of 42℃ and was flat and no folds. In addition，the cells stained with toluidine blue were in fine quality of staining，and had a clear definition of the nucleus and the cytoplasm，as well as the morphology and structure of the cells were maintained well，meaning that there were no significant differences from the section with xylene as clearing agent. In conclusion，n-heptane is a novel，safe and efficient substitute replacing xylene in the histological techniques for plants.

n-heptane；xylene；paraffin section；clearing agent

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.018

2015-09-25

国家自然科学基金项目（31070284）

涂磊，女，硕士研究生，研究方向：发育生物学；E-mail：1013773409@qq.com

张丽瑶，女，副教授，研究方向：被子植物生殖生物学；E-mail：lyzhang26@whu.edu.cn