中国新记录种毛细木霉Trichoderma capillare及功能评价

陈凯，李纪顺，张广志，王贻莲，赵晓燕，吴晓青，扈进冬，杨合同

（山东省科学院生物研究所，山东省科学院生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东　济南　250014）

中国新记录种毛细木霉Trichodermacapillare及功能评价

陈凯，李纪顺，张广志，王贻莲，赵晓燕，吴晓青，扈进冬，杨合同*

（山东省科学院生物研究所，山东省科学院生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014）

摘要：木霉菌株TW22166分离自湖南省洞庭湖滩涂湿地，该菌株分生孢子梗具有长而发达的主轴，二次分枝丰富，不规则，一般单生，分生孢子梗向顶方向着生单个瓶梗。利用ITS、tef1及rpb2序列分析，发现该菌株同Trichodermacapillare同源性达到99%以上；在以rpb2构建的系统发育进化树中，TW22166与TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］位于同一分支。该菌株在PDA平板上对9种植物病原真菌均有抑制作用，其中对Fusarium.oxysporum的抑制率为100.0%。菌株具有蛋白酶、几丁质酶及纤维素酶活性，其中蛋白酶活性较高，透明圈宽度达16.0mm。该菌株鉴定为毛细木霉Trichodermacapillare，是木霉属中国新记录种，也是一株较有潜力的生物防治菌株。

关键词：中国新记录种；毛细木霉；抑菌能力；水解酶活性

木霉属TrichodermaPers.属于半知菌亚门Deuteromycotina、丝孢纲Hyphomycetes、丝孢目Hyphomycetales的粘孢菌类Gloiosporae。现已证实其有性世代为子囊菌亚门Ascomycotina、肉座目Hypocreales、肉座科Hypocreaceae的肉座菌属Hypocrea［1］。木霉是世界性分布真菌，主要存在于土壤、腐烂的木材及杂草中，因其在工业酶制剂、抗生素及生物防治等方面的应用价值而受到广泛关注［2－3］。开展木霉属资源和系统分类研究，将丰富对我国该类群物种多样性的认识，不断发掘和扩大有应用前景的物种资源，具有重要的经济意义和学术价值。截止目前，国际上已报道木霉种类236种［4－8］，其中国内已发现的木霉种类为91种［9］，对其进行准确的分类和鉴定对于木霉的研究应用有重要意义。

本实验室于2015年4月沿洞庭湖周边滩涂湿地采集土样和水样，从69个样品中，已分离到木霉菌株171株，对分离到的木霉进行了形态学和分子生物学序列分析，发现了1个中国新记录种，即毛细木霉T.capillare。

1　材料与方法

1.1培养基

PDAm：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，链霉素0.1g，氯霉素0.3g，玫瑰红0.02g，曲酮0.5mL，蒸馏水1000mL。

PDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

SNA：KH2PO41.0g，KNO31.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

CMD：玉米粉30g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

几丁质培养基：葡萄糖0.5g，MgSO4·7H2O0.3g，（NH4）2SO41g，K2HPO41.36g，胶体几丁质10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

纤维素培养基：葡萄糖0.5g，KH2PO415g，（NH4）2SO45g，CaCl20.6g，MgSO4·7H2O0.6g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.0016g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl2·6H2O0.0037g，CMCNa10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

蛋白酶培养基：葡萄糖0.5g，明胶10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

1.2菌种分离

沿洞庭湖周边滩涂湿地采集土样和水样，利用选择性培养基PDAm分离木霉，经单孢分离后保存。

1.3形态学观察

分别在SNA、PDA和CMD上培养木霉菌株，定期观察菌落形态及分生孢子梗、瓶梗的发育形态。

1.4分子鉴定

利用OMEGA公司的FungalDNAminiKit试剂盒提取木霉基因组DNA，分别用3对引物ITS1-F/ITS4、EF1-728F/EF200R、fRPB2-5f/fRPB2-7cR进行扩增，PCR产物交上海生工生物股份有限公司进行测序，结果分别提交NCBI和ISTH网站进行比对分析。

1.5生物学功能评价

1.5.1供试植物病原真菌

立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、终极腐霉Pythiumultimum、灰葡萄孢Botrytiscinerea、大丽花轮枝孢Verticilliumdahliae、尖孢镰孢Fusariumoxysporum、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、致病疫霉Phytophthorainfestans、纹枯丝核菌Rizoctoniacerealis和串珠镰孢Fusariummoniliforme，均为本实验室保藏。

1.5.2平板抑菌实验

平板直径两端距中心35mm处分别接种直径5mm的木霉和病原真菌，以只接种病原真菌为对照，25℃培养，记录病原真菌对峙方向生长半径，计算抑制率（%）。

抑制率（%）＝（对照病菌生长半径－处理病菌生长半径）/对照病菌生长半径×100%。

1.5.3平板水解酶活性检测

主要检测蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性。配制水解酶活性检测培养基，培养基中加0.05%的曲酮抑制菌落扩散，25℃培养6d，记录水解圈宽度。

2　结果与分析

2.1菌株采集信息

菌株TW22166采集自湖南省洞庭湖，经度113°0′27.19＂，纬度29°9′19.21＂，采集时间为2015年4月20日，植被类型为杂草，采集人：李纪顺、王贻莲。

2.2菌株形态学特征

菌株TW22166的形态学特征见图1。于20、25、30、35、40℃培养3d，在SNA培养基上菌落半径分别为38、64、75、71、15mm；在PDA培养基上菌落半径分别为43、56、72、66、12mm，最适生长温度和产孢温度为30－35℃。于20℃培养7d，在SNA培养基上不产生明显的分生孢子，菌丝稀疏，成放射状扩散；在PDA培养基上形成一圈轮纹，气生菌丝稀疏，并形成孢子簇，孢子簇为颗粒状分布，灰绿色，培养基背面为淡黄色；在CMD培养基上形成一圈轮纹，白色到灰绿色孢子簇，气生菌丝稀疏，卷毛状，培养基背面为淡黄色。

分生孢子梗包括长而发达的主轴，二次分枝丰富，不规则，一般单生，少数二岐式分枝，缺乏不育菌丝。分生孢子梗向顶方向着生单个瓶梗，多数瓶梗直接产生于二次分枝上，成不对称排列，一般不是漩涡状排列。瓶梗烧瓶形或圆柱形，在中间稍微膨大，有时弯曲，瓶梗长（4.0－）6.5－10.5（－14.0）μm，最宽处（2.2－）3.0－3.5（－4.5）μm，基部宽（1.0－）2.2－2.6（－3.2）μm。

分生孢子椭圆形，黄绿色，大小为（4.4－）3.9－3.4（－2.4）×（2.8－）2.7－2.5（－2.3）μm。厚垣孢子亚球形，串生、间生或端生，产量较多，大小为（9.4－）7.8－6.4（－5.6）×（8.2－）6.7－5.5（－5.1）μm。

图1　菌株TW22166的形态特征Fig.1morphological　characteristics　of　strain　TW22166

2.3菌株序列分析

菌株TW22166的ITS序列总长为673bp，在GenBank上的登录号为KT862523，经www.isth.info中的TrichOKEY进行比对，分别在113、135、314、472、568处发现了木霉的5个DNA寡核苷酸条形编码，表明TW22166为木霉属，种类鉴定为Trichodermasp.MA3642。TW22166的tef1序列总长为664bp，在GenBank上的登录号为KT862524，同TrichodermacapillarestrainGJS99-3［JN175584.1］同源性99%，TW22166的rpb2序列总长为1104bp，在GenBank上的登录号为KT862525，同TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］同源性99%。

选取NCBI中与菌株TW22166的rpb2同源性不小于90%的序列构建系统发育进化树，结果见图2，菌株TW22166与TrichodermacapillarestrainGJS06－66［JN175530.1］位于同一分支，而与其他菌株的亲缘关系较远。

图2　以rpb2基因序列为分子标记的系统发育进化树Fig.2　Gene　sequences　rpb2　based　phylogenetic　tree

2.4菌株TW22166的平板抑菌作用

菌株TW22166在PDA平板上对供试9种植物病原真菌均具有较好的抑制作用，抑制率范围为47.0%－100.0%，其中对B.cinerea的抑制率为47.0%，对F.oxysporum的抑制率为100.0%，对其他病原真菌的抑制率介于两者之间（图3）。

图3　菌株TW22166的平板抑菌能力Fig.3　Antifungal　capability　of　strain　TW22166　on　PDA　plate

2.5菌株TW22166的水解酶活性

菌株TW22166在平板上具有蛋白酶活性、几丁质酶活性及纤维素酶活性，可产生明显的透明圈，其中蛋白酶活性较高，透明圈宽度为16.0mm，结果见图4。

A蛋白酶活性B几丁质酶活性C纤维素酶活性图4　菌株TW22166的水解酶活性Fig.4　Hydrolase　activity　of　strain　TW22166

3　结论

传统的木霉生物学鉴定主要依据形态学特征，但木霉的形态性状复杂多变且易受环境影响，缺少特有形态特征，给分类研究者对其进行种的定义造成了极大的不便。近年来，人们将传统的形态学分类方法与分子生物学技术相结合应用于木霉属的分类和系统进化问题的研究中，开创了一个真菌系统分类学的新时代，并取得了显著的成功［10］。

由于木霉的ITS和tef1序列同源性在种内、种间差异存在重叠，可能导致部分种的错误鉴定［11］，本文用rpb2序列构建系统发育进化树，结果发现菌株TW22166与TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］位于同一分支，而与其他菌株的亲缘关系较远，初步断定菌株TW22166应为Trichodermacapillare。其形态学特征也与其一致［12］，故将菌株TW22166鉴定为Trichodermacapillare。

菌株TW22166分生孢子梗形态属于长枝组Longibrachiatum，该组木霉的共同特点为菌落生长快，最适生长温度为30－35℃，在PDA上产生黄色色素，产孢簇为平展或松散的簇状。分生孢子梗形成于气生菌丝稀疏的培养物上，典型分生孢子梗包括强壮发达的中轴，初级分枝长，二级分枝通常短且少见再次分枝。瓶梗排列不规则，一般单生，烧瓶形或接近圆柱状，常为钩状或弯曲。分生孢子为椭圆或长方形。厚垣孢子有或者无。

该组种类之间可以根据瓶梗的形态变化相互区别，也可以根据分生孢子的大小和形状加以区分。T.capillare同其他长枝组木霉种的亲缘关系较远，分枝更加不规则，孢子簇上产生细丝状的气生菌丝，显著或不显著，有隔膜，弯曲，不育，已知分布为美国、欧洲（奥地利、匈牙利）、越南、中国。

菌株TW22166在平板上产生厚垣孢子的能力较强，利用这一特点，可以重点研究该菌株发酵产厚垣孢子的条件，从而提高发酵产量，制备以厚垣孢子为有效成分的木霉制剂，延长制剂的保存期及抗逆能力。而且菌株TW22166不但对植物病原真菌具有广谱抗性，还具有多种水解酶活性，是一株较有潜力的生物防治菌株。

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ChinesenewrecordTrichodermacapillareanditsfunctionalassessment

CHENKai，LIJi-shun，ZHANGGuang-zhi，WANGYi-lian，ZHAOXiao-yan，WUXiao-qing，HUJin-dong，YANGHe-tong*

（ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedmicrobiology，BiologyInstitute，BiotechnologyCenter，ShandongAcademyofSciences，Jinan250014，China）

Abstract：TrichodermastrainTW22166wasisolatedfromsoilsamplesofDongtingLakemudflatwetlandofHunanprovince，China.Itsconidiophoreshadastronglydevelopedcentralaxisfromwhichphialidesarisesinglyoverseverallevelsbelowthetipasinglephialideterminatingabasalcellwithashort，spur-likephialidearisingasanoutgrowthofthebasalcellattheseptum.Throughdetectingmolecularmarkers（ITS，tef1andrpb2），wediscoveredthatitshomologywithTrichodermacapillarewasmorethan99%byNCBI.Inrpb2sequencesbasedphylogenetictree，strainTW22166andTrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］wereononeidenticalbranch.StrainTW22166exhibitedantifungalcapabilityagainst9plantpathogenicfungionPDAplate，anditsinhibitionratioagainstFusariumoxysporumwasupto100.0%.Ithadproteinase，chitinaseandcellulaseactivity，amongwhichproteinaseactivitywashigheranditshydrolyzationradiuswas16.0mm.StrainTW22166wasidentifiedasTrichodermacapillare，aChinesenewrecordofgenusTrichodermawhichwasapotentialbiologicalpreventionandcontrolstrain.

Keywords：Chinesenewrecord；Trichodermacapillare；antifungalcapability；hydrolaseactivity

中图分类号：Q939.5；S476

文献标识码：A

文章编号：1002-4026（2016）01-0093-05

DOI：10.3976/j.issn.1002－4026.2016.01.016

收稿日期：2015-11-06

基金项目：山东省重点研发计划（2015GNC113003）；山东省攻关计划（2014GSF121028）；科技基础性工作专项（2014FY120900）

作者简介：陈凯（1968－），女，工程师，研究方向为微生物。Email：chenkai19960917＠163.com

*通讯作者，杨合同（1966－），男，博士，研究员，研究方向为应用微生物。Email：yanght＠sdas.org