贲门癌中CyclinD1蛋白的表达及意义

茹　艺，陈晓杰，张鹏飞，高社干，高　强，冯笑山



贲门癌中CyclinD1蛋白的表达及意义

茹艺，陈晓杰，张鹏飞，高社干，高强，冯笑山

摘要：目的促进贲门癌的诊断和治疗，探讨CyclinD1在贲门癌中的表达及意义。方法收集32例贲门癌和配对的癌旁组织标本，用免疫组化的方法检测贲门癌组织及其配对的癌旁组织中CyclinD1蛋白的表达水平，分析该蛋白与贲门癌临床病理的相关性，并评价CyclinD1蛋白的临床意义。结果贲门癌组织中CyclinD1阳性表达为84.8%(27/32) 高于癌旁组织的40.6%(13/32)，差异有统计学意义(P<0.05)，且与贲门癌临床分期相关(P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤分化程度和转移等无关。CyclinD1在个临床分期≥Ⅲb的阳性表达为70.6%(12/17)，在临床分期<Ⅲb的阳性表达为26.7%(4/15)，差异有统计学意义(P<0.05)。结论CyclinD1贲门癌组织中表达上调，且与临床分期相关，CyclinD1在贲门癌的发展过程中可能具有一定促进作用。

关键词：贲门癌；CyclinD1；临床分期

贲门癌在我国北方许多地区较为常见，近年来，越来越多的研究表明贲门癌是不同于食管癌和胃癌的一种恶性肿瘤，它与胃癌和食管癌的地区分布范围存在明显差异[1]，应作为一种独立的疾病来进行研究[2]。细胞周期蛋白D1(CyclinD1)属于细胞G1期的周期蛋白，具有抑制细胞增殖和分化，诱导细胞凋亡，并且改基因与基因组印记有关[3]。CyclinD1是细胞周期重要的正调控因子可导致肿瘤的发生，其过度表达在多种癌组织中均可被检测到。本研究检测CyclinD1在贲门癌及其癌旁组织中的表达，分析其与临床分期之间的关系，探讨CyclinD1在贲门癌发生、发展中的作用，现报道如下。

1资料与方法

1.1研究对象选择自2012年1月至2014年3月，河南科技大学第一附属医院胸外科手术切除的32对贲门癌及癌旁组织手术标本，全部病例均有病理诊断支持，其中男性病例30例，女性病例2例；年龄39～76岁，平均61.4岁。入选病例均属新诊断病例。病理诊断及分级参照WHO消化道系统肿瘤分类标准(2007年版)：32例病例中17例≥Ⅲb，15例<Ⅲb。标本切除后，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2主要试剂与仪器鼠抗人CyclinD1单克隆抗体(美国Santa Cruze)，辣根酶标记山羊抗兔/鼠IgG抗体(北京鼎国生物技术有限责任公司)，免疫组化S-P超敏试剂盒、DAB显色试剂盒、柠檬酸盐修复液、PBS缓冲液、苏木素染液，中性树胶、盖玻片(福建迈新生物技术开发有限公司)，30%聚丙烯酰胺凝胶(北京鼎国生物技术有限责任公司)，组织脱水机、切片机(美国莱卡公司)，组织包埋机、摊片机、烘片、烤片机(襄樊莱克生物电子仪器公司)，电热鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)，光学显微镜(日本Nikon公司ECLIPSE 80i)。

1.3方法

1.3.1HE染色按照HE常规操作步骤进行，二甲苯，无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇顺序浸泡，水洗，苏木精染色，流水冲洗，1%盐酸分化，0.5%伊红液染色，水洗，80%乙醇，95%乙醇)，无水乙醇，95%乙醇，二甲苯依次浸泡，中性树胶封片。

1.3.2免疫组织化学染色所有组织切片均进行CyclinD1免疫组织化学染色，严格按试剂盒操作步骤进行。主要步骤如下：脱蜡，水化，抗原修复，封闭，PBS漂洗，一抗(兔IgG)孵育并且4 ℃过夜，TBS漂洗10 min，二抗孵育10～30 min，PBS漂洗，DAB显色，蒸馏水漂洗，1%盐酸酒精分化，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。

1.3.3判定免疫组化的结果阅片采取用两位病理科医师双盲阅片的方法。阳性表达细胞的判断标准：①0分：完全不着色，1分：轻度淡黄着色，2分：中度棕黄着色，3分：棕褐色着色。②阳性范围的判断：0分：<5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%。①②相加分数为判定结果：阴性(-) <2分，弱阳性(+)2～3分，中度阳性 (++)4～5分，强阳性(+++)6～7分。

1.4统计学处理所有数据的统计学处理采用SPSS 18.0软件进行处理，等级资料采用Wilcoxon符号秩检验比较，计数资料采用fishers确切概率法。

2结果

2.1CyclinD1表达的检测结果细胞染色定位于胞核和胞质，胞质或胞核呈棕黄色为表达阳性，见图1。贲门癌组织中CyclinD1总阳性表达率和强阳性表达率分别为84.8%(27/32) ，18.8%(6/32)；癌旁组织为40.6%(13/32)，0(0/32)。根据Wilcoxon秩检验结果 肿瘤及癌旁组织中CyclinD1的表达差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

A，B CyclinD1在癌旁组织阴性表达；C，D CyclinD1在癌组织阳性表达。图1　CyclinD1在贲门癌和癌旁组织的表达(SP,A,C×200;B,D×400)

例

2.2CyclinD1与临床分期具有相关性肿瘤组织中CyclinD1的表达水平与临床分期有相关性，采用卡方检验，结果提示肿瘤组织中CyclinD1的表达水平与临床分期有关(P=0.03)，即临床分期越差CyclinD1表达水平越高，见表2。

表2　贲门癌病例临床特征分布

3讨论

细胞周期蛋白D1(CyclinD1)属于细胞G1期的周期蛋白。人类CyclinD1定位于染色体11q13，含有5个外显子和4个内含子。CyclinD1属于核内调控蛋白，分子量为34 kD。其N端含有一个Leu-X-Cys-X-E序列，该序列与病毒DNA原癌蛋白同源，是CyclinD1重要的功能区域。CyclinD1蛋白C端富含多种氨基酸残基，称为PEST序列，与蛋白质的转化、降解有关[3]。CyclinD1蛋白第56-141位氨基酸序列称cyclin-box，也是CyclinD1蛋白重要的功能区域，相应的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDK)可与其特异性结合。因此CyclinD1是细胞周期重要的正调控因子。

CyclinD1与肿瘤的发生密切相关，其过度表达在各种人类癌症中均可被检测到[4-8]。c-myc、ras等癌基因通路的激活与CyclinD1基因扩增关系密切[9]。在套细胞瘤中，CyclinD1蛋白活性在肿瘤组织中显著升高，且具有高度敏感性和相对特异性。所以CyclinD1被作为该肿瘤的特异性诊断指标之一[10]。研究发现在肿瘤的侵袭和淋巴结转移中CyclinD1同样具有重要作用[11-14]，有学者发现CyclinD1蛋白表达情况与食管鳞状细胞癌的浸润深度和转移有关[9]。在卵巢癌有转移组CyclinD1表达上调，而无转移组的中CyclinD1过表达下降明显[5-6]。研究发现CyclinD1在有转移的肿瘤中表达明显上调，比如胆囊癌[6]、子宫内膜[7]以及喉鳞状细胞癌[8]等，说明CyclinD1在肿瘤的病情进展中有促进作用。提示检测CyclinD1表达情况可以预测肿瘤的转移和预后[15]。

作者的研究发现肿瘤组织中CyclinD1的表达水平与临床分期有相关性(P<0.05)，即临床分期越差CyclinD1表达水平越高。说明CyclinD1在贲门癌的发展转移过程中具有一定促进作用。因此进一步深入研究CyclinD1在贲门癌中的发生发展机制和作用有着重要的意义。

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作者单位：河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003

Expression and Clinical Significance of CyclinD1 Protein in Cardia Cancer

Ru Yi, Chen Xiao-jie, Zhang Peng-fei, GAO She-gan, GAO Qiang, FENG Xiao-shan

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:Objective To investigate the expression and its clinical significance of CyclinD1 in gastric cardia adenocarcinoma(GCA).MethodsThe immunohistochemistry was used to determine the level of CyclinD1 in 32 cases of GCA tissues and its adjacent non-cancerous tissues. we also analyzed the correlation between the CyclinD1 and cardia cancer clinicopathologic characteristics, and evaluated the its clinical significance of CyclinD1 protein in cardia cancer.Results The immunohistochemistry results showed that the positive rate of CyclinD1 protein was 84.4%(27/32) in GCA and 40.6%(13/32) in its adjacent non-cancerous tissues respectively, which was significantly statistic difference(P<0.05). The CyclinD1 expression in GCA showed a significant correlation to TNM-staging (P<0.05), but no correlation was found in age, gender, tumor differentiation degree and lymph node metastasis. The positive rate were 70.6%(12/17) in the TNM stage ≥Ⅲb and 26.7%(4/15) in the TNM stage <Ⅲb (P>0.05).ConclusionThe expression of CyclinD1 was significantly higher in GCA and had correlation to clinic stage of GCA. The CyclinD1 protein may play an important role in the development of GCA.

Key words:cardia cancer；cyclinD1；clinical stage

文章编号：1672-688X(2016)02-0091-03

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.004

中图分类号：R735.1

文献标志码：A

基金项目：2011年河南省科技攻关重大项目(编号：112101310100)

收稿日期：2016-03-15

作者简介：茹艺(1978-)，男，蒙古族，河南宜阳人，主治医师，从事肿瘤医学临床、教学、科研工作。

通信作者：冯笑山，男，博士，教授，E-mail：samfeng137@hotmail.com