HPLC法测定关节疏通胶囊中白蜡树精苷的方法的建立

陈玉娟，王巍，于源华

（长春理工大学　生命科学技术学院，长春　130022）



HPLC法测定关节疏通胶囊中
白蜡树精苷的方法的建立

陈玉娟，王巍，于源华

（长春理工大学生命科学技术学院，长春130022）

摘要：通过高效液相色谱法（HPLC），建立一种检测关节疏通胶囊中的主要香豆素类成分即白蜡树精苷含量检测的方法。采用线性关系、精密度试验、8h稳定性试验、重现性实验、加样回收率试验等方法对关节疏通胶囊中的白蜡树精苷的含量检测方法进行开发，测定白蜡树精苷在0.5196～2.5980μg（r =0.9999）范围内呈现良好的线性关系，其中精密度试验、8h稳定性试验、重现性实验、加样回收率试验的RSD值均小于2%，加样回收率试验中，平均加样回收率为98.1%。对关节疏通胶囊中的主要成分白蜡树精苷进行了定量分析，选择334nm波长进行检测，减少了杂质的干扰。结果表明此法线性关系好、精密度高、准确性和重现性好、前处理相对简单，适合关节疏通胶囊中白蜡树精苷的含量检测。

关键词：关节疏通胶囊；高效液相；白蜡树精苷

水曲柳是木樨科梣属植物，民间用其树皮治疗风湿、类风湿、骨痛等疾病，作用疗效确切［1］。水曲柳叶中含有香豆素苷类成分，前期研究表明，水曲柳总香豆素苷有抗炎镇痛之功效，对类风湿性关节炎的动物模型有明显的抑制其类风湿病变进展的作用［2］。关节疏通胶囊是本课题组正在研究的一种治疗类风湿关节炎的中成药，其主要成分是从水曲柳（Fraxinus mandschurica Rupr.）中提取的总香豆素苷类［2］。根据《药品注册管理办法》（局令第28号）要求，申报的新药对其生产工艺和质量控制部分必须制定相应的可控的质量标准。水曲柳提取物中含量最多的香豆素苷类成分为白蜡树精苷，白蜡树精苷化学性质稳定，紫外吸收强；而《中国药典》和其他的药品标准中没有白蜡树精苷的检测方法的描述。本文拟采用HPLC法建立一种定量测定关节疏通胶囊中的白蜡树精苷的方法，为制定关节疏通胶囊的质量标准提供试验依据。

1　材料和仪器

1.1试验仪器

高效液相色谱（日本Shimadzu公司），配有SGU-20A3在线脱气装置，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，SPD-20A检测器，LCsolution工作站，C18色谱柱（250×4.6mm，5μm，美国Phenomenex公司）。

1.2试剂和试验材料

甲醇为分析纯，购于Fisher Scientific公司，磷酸为分析纯，购于北京化工有限公司，水为自制蒸馏水，白蜡树精苷（mandshurin）对照品自制，纯度≥99%。关节疏通胶囊试材为自制［2］，取水曲柳总香豆素提取物30g，硬脂酸镁、滑石粉、尼泊金甲酯各1g，淀粉100g，糊精117g等物质，总计250g，经过混匀、制粒、干燥、整粒、灌装等工序得到关节疏通胶囊1000粒。

2　方法和结果

2.1HPLC测定条件［3］

流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液（37∶63），流速1mL/min，柱温30℃，检测波长为334nm，进样量10μL。

2.2对照品和样品的配制

取白蜡树精苷对照品8.66mg，加甲醇30mL溶剂，定容至10mL，经过0.22μm孔径的滤膜过滤，得到浓度为866μg/mL的原液，备用。

取关节疏通胶囊内容物0.35g，加甲醇50mL超声2次，每次10min，定容至100mL，取上清液用0.22μm的滤膜过滤，取续滤液备用。

2.3方法专属性试验［4］

取对照品溶液和供试品溶液，分别进样10μL，结果见图1，对照品溶液，根据峰面积归一化法计算白蜡树精苷的含量为99.45%，供试品溶液中其他峰与白蜡树精苷的峰达到了基线分离，对白蜡树精苷的测定没有干扰。

图1　高效液相色谱图

2.4线性关系

分别精密量取白蜡树精苷的对照品原液0.6mL、1.2mL、1.8mL、2.4mL、3.0mL定容至10mL，配成浓度梯度为51.96μg/mL、103.92μg/mL、155.88μg/mL、207.84μg/mL、259.8μg/mL的溶液，进样10μL。进样量与峰面积如表1和图2所示，线性曲线为y=3E+06x+39348，线性相关系数r = 0.9999，说明进样量在0.5196μg-2.5980μg之间，进样量与所测峰面积成良好的线性关系。

表1　白蜡树精苷的进样量和所测峰面积值

图2　白蜡树精苷进样量和所测峰面积的线性关系

2.5精密度试验

精密量取白蜡树精苷原液1mL加甲醇定容至10mL，连续进样六次，结果见表2所示。

表2　精密度试验结果

2.68h稳定性实验

取供试品溶液，在配制完成后的0h、2h、4h、6h、8h时分别进样10μL，结果见表3所示。

表3　8h稳定性试验

2.7重复性试验

称取关节疏通胶囊内容物6份，每份约0.35g，精密称量，按照样品溶液配制方法，配制供试品溶液6份，进样，结果见表4所示。

2.8加样回收率实验

经过重现性试验测定关节疏通胶囊中白蜡树精苷的含量为8.68%，取相同批次的关节疏通胶囊6份，每份约0.35g，精密称量，加入已知量的白蜡树精苷对照品，按照供试品溶液配制方法进行配制溶液，进样，结果见表5。

3　讨论

文献中对于香豆素的含量测定方法很多，有采用HPLC法［5，6］，有采用LC-MS法［7］，有的采用紫外检测法［8］。由于紫外检测法杂质干扰严重，LC-MS法所用的仪器昂贵、需要专人维护，且费用高，为以后生产关节疏通的企业考虑，本文采用方法相对简单、稳定、性价比高的HPLC法检测关节疏通胶囊中的白蜡树精苷。白蜡树精苷在334nm有强的紫外吸收，而杂质的吸收相对较弱，本试验采用334nm作为检测波长。由于白蜡树精苷有较弱的酸性，在甲醇-水作为流动相时有拖尾现象，所以把水换成0.1%磷酸水溶液以修正拖尾现象［9］。

关节疏通胶囊中的配方比例是：水曲柳总香豆素提取物30g，硬脂酸镁、滑石粉、尼泊金甲酯各1g，淀粉100g，糊精117g，总计250g，制成1000粒。经过上述重现性试验测定关节疏通胶囊中白蜡树精苷的含量为8.68%，已知关节疏通胶囊中水曲柳总香豆素提取物的比例12%（30/250），所以水曲柳总香豆素提取物中白蜡树精苷的含量为72.3%。《药品注册管理办法》（局令第28号）中规定“‘未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效部位及其制剂’是指国家药品标准中未收载的从单一植物、动物、矿物等物质中提取的一类或数类成份组成的有效部位及其制剂，其有效部位含量应占提取物的50%以上”。关节疏通胶囊中白蜡树精苷的含量大于50%，符合要求。

4　结论

采用HPLC法检测关节疏通胶囊中的白蜡树精苷，进样量在0.5196～2.5980μg之间，r =0.999，说明进样量与所测峰面积成良好的线性关系；其中精密度试验、8h稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验的RSD值分别为0.13%、0.42%、0.61%、0.93%，均小于2%，说明精密度高，干扰少，重复性好，方法简单可行。此方法可以用于对关节疏通胶囊质量标准的制定中。

表4　白蜡树精苷的重现性试验结果

表5　白蜡树精苷的加样回收率试验结果

参考文献

［1］陈玉娟，王会堂，贺骊鹏，等.水曲柳皮中化学成分的研究［J］.中国药学杂志，2009，44（15）：2146-2147.

［2］长春理工大学.一种治疗类风湿性关节炎的水曲柳提取物：中国，CN 103110700 A［P］.2013-05-02.

［3］冯伟红，王智民，张启伟，等.一测多评法测定秦皮药材与饮片中香豆素类成分的含量［J］.中国中药杂志，2011，36（13）：1782-1789.

［4］赵友谊，孙浩，王鸣，等.HPLC法同时测定江苏引种白芷中5个香豆素的含量［J］.中国野生植物资源，2013，32（1）：56-58.

［5］步达，姚晓，郑紫婷，等.HPLC法测定明党参组织培养物和栽培品种香豆素成分的含量［J］.天然产物研究与开发，2014，26（10）：1638-1643.

［6］罗杠，马兴霞，罗永明，等.HPLC同时测定金粟兰植物中香豆素及倍半萜内酯类有效成分的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（1）：47-50.

［7］杨荣静，卫碧文，高欢，等.高效液相色谱-串联质谱法检测玩具中5中香豆素类致敏性香味剂［J］.色谱，2012，30（2）：160-164.

［8］施婷婷，王建新，李希.白芷总香豆素类有效部位的纯化工艺研究［J］.中药与临床，2015，6（1）：35-38.

［9］梁俊，郑江萍，黄良永.虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱研究［J］.中国药师，2015，18（4）：578-582.

Determination of Mandshurin in Guanjie Shutong Capsule by HPLC

CHEN Yujuan，WANG Wei，YU Yuanhua
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

Abstract：To establish a new method for determination of mandshurin（one kind of coumarin）in Guanjie Shutong Capsule，high performance Liquid chromatography（HPLC）was employed. HPCE was used to determine the content of mandshurin by experiments as linearity，precision，stability，reproducibility and recoveries. The linear ranges of mandshurin was 0.5196～2.5980μg（r =0.9999）by HPLC，the RSD of precision，reproducibility，stability and recoveries were all less than 2%. And the average recovery by HPLC was 98.1%. A new method was established to determine mandshurin in Guanjie Shutong Capsule. The detection wavelength is 334nm，reducing the interference of impurities. The method is with good Linear relationship，high precision，and simple，rapid，reproducible，accurate. So HPLC is more suitable for determination of mandshurin in Guanjie Shutong Capsule.

Key words：Guanjie Shutong Capsule；HPLC；Mandshurin

中图分类号：R917

文献标识码：A

文章编号：1672-9870（2016）02-0140-04

收稿日期：2015-04-17

基金项目：吉林省科技厅重点科技攻关项目（20140204052YY）

作者简介：陈玉娟（1979-），女，讲师，E-mail：jychenzxcv@163.com