百合固金汤合生脉散加减方对肺结核模型大鼠肺组织MIF、TNF-α蛋白表达的影响*

李树义　鲍承贤　董雪松　河北省唐山市第九医院(唐山063000)



·实验研究·

百合固金汤合生脉散加减方对肺结核模型大鼠肺组织MIF、TNF-α蛋白表达的影响*

李树义鲍承贤董雪松△河北省唐山市第九医院(唐山063000)

摘要目的：观察百合固金汤合生脉散加减方对肺结核模型大鼠肺组织MIF、TNF-α蛋白表达的影响。方法：将昆鼠制备肺结核模型，随机分为模型组、对照组和实验组，每组30 只。感染第 2 天开始，模型组每日灌胃生理盐水6mL/kg，连续灌胃3个月；对照组用利福平浓度3g/mL，6 mL/kg进行灌胃治疗 ；实验组应用百合固金汤合生脉散加减方，浓度3g/mL，6 mL/kg进行灌胃治疗，观察3个月。检测周围血T细胞亚群的变化和肺结核结节组织MIF、TNF-α蛋白表达变化。结果：对照组和实验组与模型组比较，周围血T细胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%有明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组和实验组与模型组比较，肺结核结节中MIF蛋白含量有明显降低，差异性有统计学意义(P<0.05)。对照组和实验组与模型组比较，肺结核结节中TNF-α蛋白含量有明显降低，差异性有统计学意义(P<0.05)；实验组与对照组比较，TNF-α蛋白含量有所降低，差异性有统计学意义(P<0.05)结论：百合固金汤合生脉散加减方可有效提高周围血T细胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%，减低肺结核结节组织MIF、TNF-α蛋白含量。

主题词结核,肺/中医药疗法百合固金汤/治疗应用生脉散/治疗应用动物实验大鼠

肺结核是一种肺部感染性疾病，祖国医学在防治此疾病具有独特的优势，本研究应用百合固金汤合生脉散加减方对肺结核鼠模型进行干预，观察肺结核结节组织MIF、TNF-α蛋白表达及周围血T细胞亚群的变化，来探究此中药复方在防治肺结核作用机制。

1材料与方法1.1 实验动物昆明种小鼠90只,雌雄各半,体重(20±5) g,清洁级,购于购于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于华北理工大学实验动物中心温度、湿度、通风良好。

1.2试剂与仪器百合固金汤合生脉散加减方(百合、熟地、生地、当归、白芍等)； 结核分支杆菌 H37Rv 购于中国药品与生物制品鉴定所；利福平胶囊购自广东金葫芦制药有限公司，批号 2013546；沈阳万类生物科技有限公司够置以下产品：BCA蛋白定量试剂盒；Western Blot一抗二抗去除液(强碱性)；Western及IP细胞裂解SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒；DAB显色试剂盒(20x)；巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体。低温高速离心机(湖南湘立科学仪器有限公司);GeIDocTMXR+成像系统(Bio-Rad )；多功能电泳仪(北京鸿涛基业科技发展有限责任公司)。

1.3方法1.3.1 分组与模型制备:常规喂养1周后随机数字随机分为3组: 模型组、对照组和实验组，每组30只。按照参考文献[1]鼠尾静脉注射5 mg/mL的结核杆菌悬液0.2mL，形成肺结核动物模型。

1.3.2 处理方法:感染第 2 天开始，模型组每日灌胃生理盐水6mL/kg，连续灌胃3个月；对照组用利福平浓度3g/mL，6mL/kg进行灌胃治疗 ；实验组应用百合固金汤合生脉散加减方，浓度3g/mL，6 mL/kg进行灌胃治疗，观察3个月。

1.4观察指标及方法1.4.1周围血T细胞亚群的变化:采集眼静脉血2mL，分离低温保存。采用MCAB-A-E花样环法,按常规操作[2]。

1.4.2 肺结核结节组织MIF、TNF-α蛋白表达的检测:将肺结核结节组织细胞裂解，离心提取组织总蛋白，取蛋白，上样到10%/15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、电转，将硝酸纤维素膜(NC)孵育兔来源 MIF、TNF-α第一抗体，4℃过夜。DBS液清洗，孵育山羊抗兔第二抗体，CL 染色，胶片显影、定影。胶片扫描后，使用 Image J 软件处理条带灰度值。

2结果2.13组周围血T细胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%的变化对照组和实验组与模型组比较，周围血T细胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%有明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)； 对照组与实验组比较，差异性无有统计学意义(P>0.05),见表1。

表1　周围血T细胞亚群的变化±s )

注：与模型组比较，∆P<0.05

2.2三组肺结核结节MIF、TNF-α蛋白含量变化 对照组和实验组与模型组比较，肺结核结节中MIF蛋白含量有明显降低，差异性有统计学意义(P<0.05)。对照组和实验组与模型组比较，肺结核结节中TNF-α蛋白含量有明显降低，差异性有统计学意义(P<0.05)；实验组与对照组比较，TNF-α蛋白含量有所降低，差异性有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　三组肺结核结节MIF、TNF-α/β-actin 比值

注：与模型组比较，∆P<0.05；与对照组比较，▲P<0.05

3讨论细胞免疫功能低下可诱发肺结核发病[3-4]，MIF对于抵抗胞内病原微生物具有先天的免疫作用，TNF-α也直接参与结核病的免疫应答，它们是参与肺结核免疫应答及免疫发病过程的重要细胞因子[5-6]。研究显示MIF、TNF-α在肺结核结节中的出现高表达，并且成正相关。两者在肺结核结节中可能互相诱导、刺激,放大炎性反应，MIF抑制巨噬细胞游走,促进其在炎症局部浸润、激活、增生并分泌炎性细胞因子，激发结核分枝杆菌的作用[7]。

中医药在防治肺结核发挥着越来越重要的作用，其中本研究中应用的百合固金汤合生脉散加减方依据与肺结核病理特点配伍组成，具有润肺生津，清热化痰止咳等作用。研究表明：百合固金汤合生脉散加减方可有效提高周围血T细胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%，减低肺结核结节组织MIF、TNF-α蛋白含量加强免疫应答，进而控制慢性感染。

参考文献

[1]TANG M,KEMP A,VARIGOS G.IL-4 and interferon-gamma pr-oduction in children with atopic disease[J].Clin Exp Immunol,1993,92(1):120-124.

[2]辛丽红,王静,王贞,等.肺炎支原体感染对哮喘患儿支气管肺泡灌洗液中T细胞功能的影响[J].中国当代儿科杂志,2014,16(3):277-280.

[3]陈廷,聂尚丹,赵建磊,等.肺结核患者免疫功能状态的研究[J].中华疾病控制杂志,2011,15(5):381-383.

[4]段静,侯超,毛源.老年与青年肺结核患者免疫功能差异的探讨[J].实用老年医学,2014,28(11):937-940.

[5]李静.MIF基因启动子多态性与肺结核病遗传易感性关系的研究[D].硕士学位论文昆明医科大学基础医学院2014,5:73-74.

[6]李红,唐神结.肺结核患者外周血SIL-2R、TNF-α、IFN-γ、IL-6检测及意义[J].中国防痨杂志,2011,33(1):57-60.

[7]漆沄,石志红,苟超伦.MIF、TNF-A在肺结核组织中表达和意义的初步探讨[J].中国防痨杂志,2011,33(3):153-157.

(收稿2015-10-09;修回2015-11-13)

【中图分类号】R256.17

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.02.047

通讯作者：∆ 唐山市第四医院 (唐山063000)

*国家自然基金资助项目(81303046)

河北省中医药管理局科研计划项目(2015163)