大花绿绒蒿内生真菌Neurospora sp.DHLRH-F次级代谢产物研究*

黄梅香，胡谷平，陈 彬，徐爱国，普布多吉，蒋思萍，王 军

(1.中山大学药学院，广东 广州510006;2. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州510275;3. 西藏自治区高原生物研究所，西藏 拉萨850001)

大花绿绒蒿内生真菌Neurospora sp.DHLRH-F次级代谢产物研究*

黄梅香1，胡谷平2，陈 彬3，徐爱国3，普布多吉3，蒋思萍3，王 军1

(1.中山大学药学院，广东 广州510006;2. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州510275;3. 西藏自治区高原生物研究所，西藏 拉萨850001)

为了研究藏药大花绿绒蒿内生真菌Neurosporasp. DHLRH-F的次级代谢产物，采用硅胶、C-18反相硅胶、Sephadex LH-20等柱色谱及HPLC技术对其发酵物进行了系统分离；采用波谱分析技术进行化合物结构鉴定；采用光度法研究所得化合物对Fe2+，Fe3+的络合能力。结果从大花绿绒蒿内生真菌Neurosporasp. DHLRH-F的发酵物中分离得到3个多羟基化合物，分别鉴定为2-氯-6-甲氧基间苯二酚(1)、 6-epi-5′-hydroxy-mycosporulone (2)、霉酚酸(3)。本文是首次关于绿绒蒿属植物内生真菌次级代谢产物研究的报道；分离得到的化合物1是新天然产物，有一定的络合Fe3+能力。

大花绿绒蒿；内生真菌；次级代谢；铁离子(Ⅱ,Ⅲ)络合物

大花绿绒蒿MeconopsisgrandisPrain是罂粟科绿绒蒿属植物。绿绒蒿属植物适宜的生长环境为高海拔地区，全属49种，除1种分布于西欧外，其余均分布于东亚的喜马拉雅地区和横断山脉[1]。大花绿绒蒿生长在海拔高度为3 000～5 500 m的高寒地带，是西藏特有植物，素有高原美人之称。大花绿绒蒿也是重要藏药毛瓣绿绒蒿的代用药，全草入药，具有清热解毒、利尿、消炎、止痛、镇咳等功效，用于肺炎、肝炎、咳喘等疾病的治疗。因人工种植不易，大花绿绒蒿作为毛瓣绿绒蒿的代用药成为了濒危植物[2-3]。为了研究内生真菌在濒危植物保护中的生态学意义，探讨内生真菌次级代谢产物对濒危藏药的保护及对濒危藏药次级代谢生物合成的互惠关系，课题组前期对多种濒危藏药进行了内生真菌的系统分离研究，从原生态大花绿绒蒿植株中分离得到了40株内生真菌。在此基础上，本文对具有较好抗菌活性的大花绿绒蒿内生真菌Neurosporasp. DHLRH-F的次级代谢产物进行了系统研究，分离鉴定了3个化合物(图1)，分别是2-氯-6-甲氧基间苯二酚(1)、 6-epi-5′-hydroxy-mycosporulone(2)、霉酚酸(3)。文献检索证实化合物1是一个新天然产物，进一步研究还发现1有较强的铁离子络合能力。大花绿绒蒿的次级代谢产物从未被文献报道过，本文是首次关于绿绒蒿属植物内生真菌次级代谢产物研究的报道。

图1 化合物1，2，3结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1, 2, 3

1 仪器与材料

UV-2501 PC紫外可见分光光度计(Shzmadzu)，Bruker AVANCE 400型核磁共振谱仪(Bruker Biospin,Rheinstetten,German)，LCQ-DECA-XP型液相色谱-质联用仪(Thermo)，Essentia SPD-16型高效液相色谱仪(HPLC)(Shzmadzu)。TLC硅胶(GF254)、柱层析硅胶(200～300 m)均为青岛海洋化工有限公司产品，Sephadex LH-20凝胶为美国GE Healthcare产品，C-18反相硅胶ODS-A为日本Daiso公司产品；色谱纯甲醇为Merck产品，其他试剂均为分析纯，为广州化学试剂厂产品。

大花绿绒蒿样本于2010年7月21日采自西藏自治区山南地区错那县那朗村东边山坡上(E: 91°56′08.52″,N: 28°02′05.06″，海拔4 574 m)。将大花绿绒蒿活株连土带根挖起放入洁净的花盆中，3 d内带回实验室，次日进行植株内生真菌分离。该样本经西藏自治区高原生物研究所李晖研究员鉴定为大花绿绒蒿(MeconopsisgrandisPrain)。

2 方法与结果

2.1 内生真菌分离

采用φ=0.2%升汞进行植物表面消毒，培养基为PDA培养基[4]；共分离得到内生真菌40株，其中编号为DHLRH-F的菌株经分子生物学鉴定为脉胞菌属Neurosporasp.，命名为Neurosporasp.DHLRH-F，GenBank 登录号为KR492687；该菌种保存于西藏自治区高原生物研究所。

2.2 发酵与提取

将菌种种子接种到盛有大米培养基的1 L三角瓶中，共接种50瓶[5]，常温发酵培养28 d。发酵物采用甲醇-氯仿-乙酸乙酯混合溶液(V(甲醇)/V(氯仿)/V(乙酸乙酯)= 1/1/1) 提取浸泡，300 mL/瓶，过滤，回收有机溶剂，剩余的水用乙酸乙酯等体积萃取3次，浓缩乙酸乙酯萃取液，得浸膏60 g。

2.3 分离纯化

将提取物浸膏悬浮于1.5 L水中，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇等体积萃取2次，分别减压蒸干有机溶剂，得石油醚部位浸膏20 g，乙酸乙酯部位浸膏15 g，正丁醇部位浸膏5 g。乙酸乙酯部位浸膏经C18反相硅胶柱纯化，水-甲醇溶液梯度洗脱，收集水-甲醇(V(水)/V(甲醇)= 90/10) 洗脱液得馏分Fr-1，水-甲醇(V(水)/V(甲醇)= 40/60) 洗脱液得馏分Fr-2。Fr-1经LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，再经HPLC分离，水-甲醇(V(水)/V(甲醇)=40/60) 溶液洗脱，得到化合物1(60 mg)。Fr-2经硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯(V(石油醚)/V(乙酸乙酯) =100/0～0/100)溶液洗脱，得到2个馏分Sr-1，Sr-2；Sr-1经Sephadex LH-20凝胶柱多次纯化，甲醇洗脱，得到化合物3(400 mg)；Sr-2经HPLC分离，水-甲醇(V(水)/V(甲醇)= 50/50) 溶液洗脱，得到化合物2(59 mg)。

2.4 Fe2+，Fe3+络合实验

分别精密称取化合物1、2、3、FeCl2及FeCl3溶于甲醇中，配成浓度为10 mmol/L 的溶液。测量时将各化合物溶液与铁离子溶液按比例混合，置于1 cm的石英比色皿中，在190～500 nm波长范围进行吸光度扫描，记录光谱数据；计算时扣除试剂空白。

化合物1与Fe3+络合实验方法参考文献[8]。

3 化合物波谱数据

化合物1：浅棕红色固体，易溶于甲醇，丙酮，氯仿；ESI-MSm/z：173 [M-H]-(100),175 [M-H]-(30); 分子式为C7H7ClO3。1H NMR(400 MHz,C2D6CO)δ: 6.73(d,1H,2.8 Hz,H-3),6.78(d,1H,2.8 Hz,H-5),4.70(s,3H,H-7);13C NMR(100 MHz,C2D6CO)δ: 131.0(s,C-1),120.9(s,C-2),115.0(d,C-3),151.2(s,C-4),114.0(d,C-5), 144.3(s,C-6),61.6(CH3-6)。

化合物2：白色固体，易溶于丙酮，甲醇；ESI-MSm/z：223.1 [M-H]-1； 分子式C11H12O5；1H NMR (400 MHz, C2D6CO)δ: 4.35 (m, 1H, H-2), 6.05 (dd, 1H, 10.4, 3.2 Hz, H-4), 6.66 (dd, 1H, 10.4, 2.4 Hz, H-5), 3.41 (m, 1H, H-6), 5.40 (m, 1H, H-5′), 4.76 (t, 1H, 2.4 Hz, H-6′α), 4.66 (t, 1H, 2.4 Hz, H-6′β), 1.21 (d, 3H, 7.2 Hz, CH3-6), 5.81 (br, OH-9)；13C NMR (100 MHz, C2D6CO)δ: 61.1 (s, C-1), 73.1 (d, C-2), 197.3 (s, C-3), 126 (d, C-4), 152.2 (d, C-5), 34.1(d, C-6), 172.5 (s, C-2′), 159.9 (s, C-4′), 69.5 (d, C-5′), 87.8 (t, 6′), 16.7 (CH3-6)。化合物2的立体构型由NOE谱推导。2的所有波谱数据与文献[6]报道的6-epi-5′-hydroxy-mycosporulone吻合。

化合物3：白色固体，易溶于氯仿；ESI-MSm/z：319.3 [M-H]-;分子式为C17H20O6;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ: 5.15(s,2H,H-3),3.35(d,2H, 6.8 Hz,1′),5.22(t,1H,6.0 Hz,H-2′),2.27(t,2H,7.6 Hz,H-4′),2.40(t,2H,7.6 Hz,H-5′),2.11(s,3H,CH3-4),1.77(s,3H, CH3-3′),3.73(s,3H,CH3O);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ: 173.1(s,C-1),70.1(t,C-3), 116.8(s,C-4), 144.2(s,C-3a),163.7(s,C-5),122.0(s,C-6),153.6(s,C-7),106.4(s,C-7a),22.6(t, C-1′),123.0(d,C-2′),134.0(s,C-3′),34.3(t,C-4′),32.8(t,C-5′),179.3(s,C-6′),11.5(q,CH3-4), 16.2(q,CH3-3′),61.1(q,CH3O)。以上数据与文献[7]报道的霉酚酸吻合。

4 结果与讨论

4.1 化合物1结构确定

化合物1的ESI-MS谱给出准分子离子峰m/z: 173[M-H]-(100)，同位素峰m/z: 175[M+2]-(30)，表明分子中有氯元素存在；结合NMR数据，确定分子式为C7H7ClO3，不饱和度为4。13C NMR谱给出7个碳信号，其中6个为sp2碳信号，1个为氧取代的sp3碳信号；1H NMR谱在δ为6.78、6.73的AB耦合信号，耦合常数J=2.8 Hz，证实芳环上有2个间位质子；δ为4.71的单峰信号证实了连氧甲基的存在；化合物1的HMBC谱给出H-3和C-2的相关信号，确定氯原子为C-2位取代；H-5和C-6的HMBC相关信号，以及H-7和H-5的NOE相关信号，确定了甲氧基为C-6位取代(图2)。综上所述，化合物1的结构确定为2-氯-6-甲氧基间苯二酚。文献检索证实，该化合物为新天然产物。

图2 化合物1主要HMBC和NOE信号Fig.2 The key HMBC and NOE correlations of compound 1

4.2 Fe2+、Fe3+络合能力

植物在生长过程需要微量元素做养料，Fe3+因水溶性差，较难被植物吸收利用。共生微生物分泌的铁载体可以通过螯合土壤中Fe3+并将其传递到植物体内，提高植物对营养物质的吸收，从而增加植物在极端环境的生长能力[9-10]。为了研究内生真菌Neurosporasp. DHLRH-F的生态学意义，本文初步研究了化合物1，2，3对Fe2+、Fe3+的络合能力。实验结果给出化合物1有较强的络合Fe3+能力，未观察到化合物2，3络合Fe3+的现象；未观察到化合物1，2，3络合Fe2+现象。

图3 化合物1-Fe3+紫外吸收光谱Fig.3 The UV-absorbance of compound 1- Fe3+

化合物1可形成Fe3+络合物的结论，被固定配基浓度(图3(a))及固定Fe3+浓度(图3(b))这两种2种络合方式证实，化合物1-Fe3+体系紫外吸收曲线在λ= 250～275 nm范围内出现新的吸收峰；在固定配基浓度的络合方式中，可观察到等吸收点的形成。根据图3(b)中λ=264 nm处的吸光度值，初步推断，当配基浓度较低时，化合物1-Fe3+络离子的络合比为2∶1[8]。

来自大花绿绒蒿的内生真菌Neurosporasp. DHLRH-F能产生较大量的Fe3+离子络合剂，其生态学意义有待进一步深入研究。

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Secondary metabolites of endophytic fungusNeurosporasp. DHLRH-F fromMeconopsisgrandisPrain

HUANGMeixiang1,HUGuping2,CHENBin3,XUAiguo3,PUBUDuoji3,JIANGSiping3,WANGJun1

(1. School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510006,China;2. School of Chemistry and Chemical Engineering,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China;3. Tibet Platesu Institute of Biology,Lhasa 850001,China)

To study the secondary metabolites of endophytic fungusNeurosporasp. DHLRH-F fromMeconopsisgrandisPrain from Tibet, its fermentation products were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20, ODS-18 column chromatography, and HPLC. The structures of obtained compounds were identified by NMR and MS analysis, and the absorption spectrums of the compounds-iron (Ⅱ) or iron (Ⅲ) were investigated by UV/Vis spectroscopy, respectively. The results showed that three polyphenols were isolated from the fermentation compounds ofNeurosporasp. DHLRH-F. Their structures were identified as 2-chloro-6-methoxybenzene-1,4-diol (1), 6-epi-5′-hydroxy-mycosporulone (2), and mycophenolic acid (3); compound 1 was a new natural product and showed a certain complexation ability for iron (Ⅲ). We firstly reported about secondary metabolites of endophytic fungus fromMeconopsisVig..

MeconopsisgrandisPrain; endophytic fungus; secondary metabolites; complex iron(Ⅱ,Ⅲ)

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.015

2015-06-03

西藏自治区科技计划重点资助项目(毛瓣绿绒蒿等濒危藏药材内生菌次级代谢及其与宿主互惠共存关系研究(2011))；国家自然科学基金地方科学基金资助项目(21262033)

黄梅香(1990年生)，女；研究方向：天然产物化学；通讯作者：蒋思萍，王军；E-mail:tpibjiangsp@126.com，wjun@mail.sysu.edu.cn

O629.9

A

0529-6579(2016)02-0081-04