不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物与甘蔗互作防御酶差异的研究

徐刚红,沈万宽,吴夏明,陈　双,罗明珠,陈培寿

(华南农业大学 农学院,农业部华南地区作物栽培科学观察实验站,广东 广州　510316)



不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物与甘蔗互作防御酶差异的研究

徐刚红,沈万宽,吴夏明,陈双,罗明珠,陈培寿

(华南农业大学 农学院,农业部华南地区作物栽培科学观察实验站,广东 广州510316)

摘要：为研究来源于不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物侵染寄主甘蔗防御酶活性变化差异,采用注射接种法,将5个不同遗传类群的代表分离物(分离物编号依次为16,24,25,47,89号)侵染抗病甘蔗品种Q171和感病甘蔗品种ROC22,测定甘蔗与甘蔗黑穗病菌分离物互作过程中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果表明:5株分离物侵染引起的寄主甘蔗SOD、POD、CAT活性变化曲线中均存在2个酶峰值,抗病甘蔗品种Q171中PPO和感病甘蔗品种ROC22中PAL也存在2个酶峰值，接种后1 d出现峰值Ⅰ,接种后3～5 d出现峰值Ⅱ。其中峰值Ⅱ时期,5株分离物侵染的甘蔗上述5种防御酶活性均高于对照,但不同分离物侵染的甘蔗SOD、POD、PAL活性的峰值Ⅱ大小及出现时间表现出差异,尤其是89号分离物峰值Ⅱ比其余4个分离物峰值Ⅱ出现时间提早1～2 d且峰值差异明显。初步认为89号分离物可能代表着与其他分离物不同的致病型生理小种。

关键词：甘蔗;甘蔗黑穗病菌;防御酶

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)属重要的糖料作物及较有发展潜力的可再生生物质能源作物。我国是世界上第三大甘蔗糖生产大国(位于巴西、印度之后),广西、云南、广东是我国三大甘蔗糖产区。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisoriumscitamineum)引起的甘蔗黑穗病是一种世界性主要甘蔗病害,几乎世界上所有的甘蔗生产国或地区都有甘蔗黑穗病发生的报道[1],该病严重影响甘蔗的产量和品质[2]。近20年来,甘蔗黑穗病在我国蔗区普遍发生,现有主栽品种普遍抗性较差,经济损失严重,该病已严重威胁我国甘蔗产业的可持续发展。由于甘蔗黑穗病潜伏期长,发病率高,药剂防治效果极差,因此深入研究甘蔗对黑穗病的防御机制,选育抗黑穗病甘蔗品种是控制甘蔗黑穗病的重要措施之一[3]。以往对甘蔗黑穗病的研究主要集中在病原菌形态特征、快速检测、遗传多样性、生理小种及病原菌与甘蔗互作等方面[4-9],而对甘蔗黑穗病菌侵染寄主甘蔗后寄主体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)等抗性酶的变化规律报道较少,至今未见不同分子遗传背景甘蔗黑穗病菌分离物与甘蔗抗性酶活性关系的报道。本研究在华南农业大学农学院甘蔗研究室对我国90个甘蔗黑穗病菌分离物分子遗传多样性研究的基础上,筛选出5株不同遗传类群的代表性分离物,通过对这5株分离物侵染不同抗性甘蔗品种后的寄主甘蔗主要防御酶活性变化的比较分析,旨在探讨不同分子遗传类群的甘蔗黑穗病菌分离物与寄主互作防御酶活性变化差异,为甘蔗黑穗病菌生理小种鉴定提供参考依据。

1材料和方法

1.1供试材料

供试菌株:来源于华南农业大学农学院甘蔗研究室对我国90个甘蔗黑穗病菌分离物遗传多样性研究中的5个遗传聚类组中的代表菌株,编号分别为:16,24,25,47,89号分离物(表1)。分离物活化后“+”、“-”交配型分离物按1∶1(体积比)配成5×106孢子/mL的黑穗病菌孢子悬浮液,作为接种源。

供试甘蔗品种:高感甘蔗黑穗病品种新台糖22(ROC22)和高抗甘蔗黑穗病品种Q171,来自于华南农业大学甘蔗亲本资源圃。供试材料于2014年12月种植于黑色塑料盆中,两品种各种植30盆,每盆4株苗。

表1　甘蔗黑穗病菌分离物信息

1.2接种及采样

待甘蔗幼苗长至5-6叶期时,对甘蔗小苗进行注射接种,注射接种点位于蔗株生长点下1 cm处。每个分离物每品种接种5盆(即20株甘蔗小苗/品种/分离物),以无菌水作为空白对照(CK),接种量为每株苗接种100 μL。接种后第0,1,2,3,4,5,6 天取样,每个处理3次重复,每个重复取3株苗+1叶混合作为样品。样品保存于-80 ℃冰箱,用于酶活性的测定。

1.3粗酶液的提取

参照Moerschbacher等[10]的方法,稍加改变,去掉叶片中脉,称取鲜样0.3 g,液氮研磨,加2 mL 0.1 mol/L pH值8.8 的硼酸缓冲液(含1 mmol/L EDTA-Na2和5 mmol/L β-巯基乙醇)匀浆,转入离心管,再用4 mL硼酸缓冲液冲洗研钵及研棒然后一并转入离心管,4 ℃下振荡5 min,同样温度下8 000 r/min离心15 min,转移上清液置于-20 ℃贮存,用于超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)的活性测定。

1.4SOD活性测定

参照陈建勋和王晓峰[11]的方法,3 mL反应体系中含13 mmol/L 甲硫氨酸,75 μmol/L NBT,10 μmol/L EDTA-Na2,2.0 μmol/L核黄素,0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8),加入50 μL的酶液(对照管以缓冲液代替),混匀。1只对照置于暗处,3只对照和样品置于4 000 lux日光灯下反应20 min。反应结束后,以不光照对照做空白,分别测定其他反应液在560 nm波长下的吸光值。酶活性单位以抑制NBT光化反应50%为1个酶活性单位表示。

1.5CAT活性测定

参照陈建勋和王晓峰[11]的方法,3 mL反应体系包括0.3% H2O21 mL,H2O 1.95 mL,最后加50 μL的酶液,对照以H2O代替,迅速混匀,在240 nm波长处进行比色,立即开始计时,每隔30 s记录一次吸光值,共测2 min。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。

1.6POD活性测定

参照陈建勋和王晓峰[11]及李杨瑞等[12]的方法,3 mL反应体系包括0.3% H2O21 mL、0.2% 愈创木酚 0.95 mL,0.05 mol/L pH值7.0 磷酸缓冲液1 mL,最后加50 μL的酶液,对照以缓冲液代替,迅速混匀,在470 nm波长处进行比色,立即开始计时,每隔30 s记录一次吸光值,共测2 min。将每分钟OD增加0.1定义为1个活力单位。

1.7PAL活性测定

参照李合生[13]和金庆超等[14]的方法,4 mL反应体系包括0.02 mol/L L-苯丙氨酸1 mL,0.1 mol/L pH值8.8硼酸缓冲液2 mL,然后加酶液1 mL,对照以缓冲液代替,混匀后,立即在290 nm处测起始OD值,并精确计时。将测定后的各管于38 ℃水浴保温30 min,冰浴终止反应,再于290 nm处测定各管的OD值。以每30 min,OD增加0.01定义为1个活力单位。

1.8PPO活性测定

参照曹建康等[15]和杨丽涛等[16]的方法,稍加改变,3 mL 反应体系包括0.02 mol/L领苯二酚 0.5 mL,0.1 mol/L pH值7.0磷酸缓冲液2 mL,最后加0.5 mL酶液,对照以缓冲代替,迅速混匀,在398 nm波长处进行比色,立即开始计时,每隔30 s记录一次吸光值,共测2 min。以每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。

2结果与分析

2.1超氧化物歧化酶(SOD)

抗、感甘蔗品种Q171和ROC22接种甘蔗黑穗病菌后SOD活性变化如图1:SOD活性在抗、感品种中变化趋势基本一致,总体表现为“上升-下降-上升”的趋势,接种后1 d均出现峰Ⅰ。在抗病品种Q171中,89号分离物处理出现3个峰值,接种后第3天出现峰值Ⅱ,第5天出现峰值Ⅲ;16,24号分离物处理在接种后第4天出现峰值Ⅱ,25,47号分离物处理在第5天出现峰值Ⅱ。峰值Ⅱ时,接种不同分离物的甘蔗SOD活性都高于对照,且不同分离物间的甘蔗SOD活性差异明显,接种第4天，16号分离物与89号分离物间差异达显著水平，接种第5天，16,24号分离物与25,47,89号分离物间差异达显著水平。在感病品种ROC22中,89号分离物在接种后第4天出现峰值Ⅱ,其余4个分离物在第5天出现峰值Ⅱ。峰值Ⅱ时期各分离物处理SOD活性均高于对照,不同分离物间SOD活性差异不明显。

a、b表示同一时间内在0.05水平差异显著。图2-5同。

2.2过氧化物酶(POD)

抗、感甘蔗品种Q171和ROC22与甘蔗黑穗病菌的互作过程中,POD活性变化总体表现为“上升-下降-上升”的趋势,接种后1 d出现峰Ⅰ。在抗病品种Q171中,24,89号分离物接种后第4天出现峰值Ⅱ,16,25,47号分离物接种后第5天出现峰值Ⅱ。峰值Ⅱ时期,所有分离物处理的甘蔗POD活性均高于对照,不同分离物间的POD活性差异不明显。在感病品种ROC22中,25,47,89号分离物接种后第4天出现峰值Ⅱ,16,24号分离物接种后第5天出现峰值Ⅱ。峰值Ⅱ时期,所有分离物处理的甘蔗POD活性均高于对照,各分离物间的POD活性差异明显,其中16号分离物与47号分离物间差异达显著水平(图2)。

2.3过氧化氢酶(CAT)

抗、感甘蔗品种Q171和ROC22与甘蔗黑穗病菌的互作过程中,CAT活性变化明显。在抗病品种Q171中,89号分离物处理的甘蔗CAT活性呈稳定上升趋势,并不出现明显的峰值,而16,24,25,47号分离物处理的甘蔗CAT活性在接种后第1天有出现峰值的趋势,但不明显,分别在第3,5天出现峰值Ⅰ、峰值Ⅱ。5个分离物的甘蔗CAT活性在第5天后均高于对照,各分离物间差异明显,其中47号分离物与89号分离物间差异达显著水平。在感病品种ROC22中,所有分离物接种后第1天均出现峰值Ⅰ,24,25,89号分离物第3天出现峰值Ⅱ,16,47号分离物第4天出现峰值Ⅱ;接种第4天后,各分离物处理CAT活性均高于对照,各分离物间差异较大,接种后第6天89号分离物与24号分离物间差异达显著水平(图3)。

图2　甘蔗与甘蔗黑穗病菌互作过程中POD活性变化

图3　甘蔗与甘蔗黑穗病菌互作过程中CAT活性变化

2.4苯丙氨酸解氨酶(PAL)

抗、感甘蔗品种Q171和ROC22与甘蔗黑穗病菌的互作过程中,PAL活性变化明显。抗病品种Q171接种后,各分离物处理的甘蔗PAL活性稳定上升,89号分离物接种后第3天出现峰值Ⅰ,16,25号分离物第4天出现峰值Ⅰ,24,47号分离物第5天出现峰值Ⅰ。接种4 d后,除25号分离物外,其余4个分离物处理的甘蔗PAL活性均高于对照,各分离物处理间差异明显,接种第3天，89号分离物与24,25,47号分离物间差异达显著水平,接种第5天,47号分离物与25号分离物间差异也达显著水平。感病品种ROC22接种后1 d各分离物处理均出现峰值Ⅰ,16,47,89号分离物处理第4天出现峰值Ⅱ,24,25号分离物处理第5天出现峰值Ⅱ。各分离物峰值Ⅱ时期PAL活性都高于对照,接种第4天，16号分离物与25号分离物间差异达显著水平，接种第5天，89号分离物与24号分离物间差异达显著水平(图4)。

图4　甘蔗与甘蔗黑穗病菌互作过程中PAL活性变化

2.5多酚氧化酶(PPO)

抗、感甘蔗品种Q171和ROC22与甘蔗黑穗病菌的互作过程中,PPO活性变化明显。抗病品种Q171接种后第2,5天出现峰值Ⅰ和峰值Ⅱ,峰值Ⅱ值大于峰值Ⅰ值;接种第5天,除25号分离物处理外,其他4个分离物处理的甘蔗PPO活性均大于对照,各分离物间差异不显著。感病品种ROC22接种后PPO活性呈一稳定上升单峰曲线,第5天出现峰值Ⅰ;在峰值Ⅰ时期,除89号分离物处理外,其余4个分离物处理的甘蔗PPO活性均大于对照,各分离物间差异不显著(图5)。

图5　甘蔗与甘蔗黑穗病菌互作过程中PPO活性变化

3讨论

SOD、CAT、POD是细胞内防御酶系统的主要成员,是活性氧清除酶类,能抵御活性氧和氧自由基对细胞膜系统的伤害,对细胞具有保护作用。本试验中,接种不同遗传类群分离物的抗、感甘蔗品种SOD活性总体均呈现先上升,后下降,再上升的两峰值的趋势,这与孔凡明等[17]研究烟草/TMV互作的结果和李赤等[18]研究香蕉/香蕉枯萎病菌互作结果有差别,与邹芳斌等[19]研究黄瓜/枯萎病互作和莫凤连[20]研究甘蔗/甘蔗黑穗病互作中抗性酶活性变化曲线存在2个峰值的结果是一致的。SOD活性在接种后1 d出现峰值Ⅰ和4～5 d峰值Ⅱ,与莫凤连[20]的结果相比,峰值Ⅰ和峰值Ⅱ出现的时间提前2 d,这可能与选择的寄主甘蔗品种抗病性有关。抗、感2个甘蔗品种的各分离物处理的第Ⅱ峰值时期(4～5 d)SOD活性均比对照高,与宋培玲等[21]和汪红等[22]的结果一致。健康的植株内本身存在SOD,在体内维持着动态平衡,当病原菌侵入后,启动SOD防御体系,因此在感病高发期,接种病原菌植株SOD活性均高于对照。本研究中,接种后抗病品种Q171的CAT活性除89号分离物呈稳定上升趋势，其他4个分离物均呈现一上升的双峰值曲线,分别在接种后第3,5天出现峰值Ⅰ和峰值Ⅱ;而感病品种ROC22分别在接种后第1天和第3～4天出现峰值Ⅰ和峰值Ⅱ,但峰值小于抗病品种Q171。本研究中,接种后抗、感品种的POD活性变化幅度不大,但始终处于较高活性水平,总体呈现先上升,后下降,再上升的趋势,第4天后,各分离物处理的甘蔗POD活性均高于对照,但各分离物间差异不明显。许莉萍等[23]认为POD可以作为一个甘蔗抗黑穗病生理指标,Armas等[2]认为黑穗病菌侵染引起甘蔗POD活性升高,POD活性增加是甘蔗抵御黑穗病菌的重要防御机制,但不是防御机制中的决定性因素。左示敏等[24]在研究水稻/纹枯病菌毒素互作中发现,SOD酶系统启动要早于POD酶系统。王海河等[25]认为在寄主抗病性反应过程中,SOD酶系统的启动时间比启动POD酶系统的时间早,POD酶防御系统是SOD酶防御系统的补救体系。本试验中,SOD比POD对甘蔗黑穗病菌入侵反应更敏感,酶活变化幅度更明显。因此,可以初步认为POD酶防御系统是SOD酶防御系统在甘蔗抗黑穗病菌入侵的补救系统。

PAL、PPO是次生代谢有关酶类。PAL催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素,是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶。PPO的作用机制是将细胞代谢产物中的酚类物质氧化为醌类来杀死细胞限制病原物进一步扩展[26]。有关学者研究认为PAL、PPO在植株受病原菌侵染后其活性升高,与抗病性呈正相关,可将PAL、PPO作为衡量植株抗性的生理指标[27-28]。本试验接种后,抗病品种Q171和感病品种ROC22的PAL、PPO活性明显升高,抗病品种Q171的酶活性及酶活性升高幅度均高于感病品种ROC22,这与酶活性与抗病性呈正相关的结论一致[29-30],也与Santiago等[31]认为抗性品种比易感品种酶活能维持更长时间,更高活性水平的结论相一致。

王海河等[25]在研究黄瓜花叶病毒不同毒性毒株与烟草细胞内防御酶系统的关系时发现,致病力极强的毒株在侵染寄主后可能造成防御酶系统崩溃或抑制防御酶系统,致病力弱的毒株可以诱导寄主细胞防御酶体系产生抗性反应,寄主细胞中SOD、PPO、PAL酶系统对不同致病力毒株入侵的反应明显不同,认为同一寄主内防御酶活性可以作为病毒毒株致病力的鉴别指标。本研究中,从试验结果可以看出,接种不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物的甘蔗SOD、POD、PAL对病原菌入侵的反应速度和强度都表现出差异,尤其是在反应速度上,5株分离物处理的甘蔗SOD、POD、PAL酶活分别在接种后3～5 d的不同时间里出现峰值Ⅱ,但89号分离物处理的甘蔗SOD、POD、PAL出现峰值Ⅱ的时间比其余4株分离物提早1～2 d,且89号分离物处理的抗病品种Q171的SOD、CAT、PAL与24、47号分离物间的差异在接种后第3-6 d不同时间里能达到显著水平。表明89号分离物与甘蔗互作引起的寄主甘蔗主要防御酶活性变化与来源于其余4个不同遗传类群的4株分离物引起的寄主甘蔗防御酶活性变化存在明显差异。89号分离物的致病力与其余4株分离物是否存在明显差异或代表着一个不同生理小种,有待于进一步测定其致病力。

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Study on the Difference of Defensive Enzyme Activities in Interaction BetweenSporisoriumscitamineumIsolates from Different Molecular Genetic Groups and Sugarcane

XU Ganghong,SHEN Wankuan,WU Xiaming,CHEN Shuang,LUO Mingzhu,CHEN Peishou

(College of Agronomy,South China Agricultural University,Scientific Observing and Experimental Station of Crop Cultivation in South China,Ministry of Agriculture,Guangzhou510316,China)

Abstract：In order to investigate the changes of defensive enzyme activities in sugarcane infected by Sporisorium scitamineum isolates originated from different molecular genetic groups.Five representative S.scitamineum isolations,including isolates 16,24,25,47 and 89,were injected to the resistant variety Q171 and susceptible variety ROC22 by using injected inoculation method.The activities of superoxide dismutase(SOD),peroxidase(POD),catalase(CAT),phenylalanine ammonialyase(PAL)and polyphenol oxidase(PPO)were determined during the interactions of Q171 and ROC22 sugarcane varieties with isolates of S.scitamineum.The results showed that the activities of SOD,POD and CAT existed 2 peaks,PPO of resistant variety Q171 and PAL of susceptible variety ROC22 also existed 2 peaks.PeakⅠappeared in the first day,peak Ⅱ appeared in the third to fifth days after inoculation.During the peak Ⅱ,activities of five defensive enzymes mentioned above were higher in sugarcane plants inoculated by five isolates of S.scitamineum than those in the corresponding non-inoculated controls.However peak Ⅱ values and occurrence time of the SOD，POD and PAL showed significant difference among five isolates.Especially,peak Ⅱ of isolate 89 was earlier 1-2 days than other four isolates in the occurrence time and its value also showed significant difference from other isolates.It was initially considered that the isolate 89 might be represent a new physiological race which was different from other four isolates.

Key words:Sugarcane;Sporisorium scitamineum;Defensive enzyme

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.035

中图分类号：S435.3

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0218-06

作者简介：徐刚红(1990-),男,湖南张家界人,在读硕士,主要从事甘蔗生物技术研究。通讯作者：沈万宽(1969-),男,江苏泰州人,研究员,博士,主要从事甘蔗抗病育种与生物技术研究。

基金项目：广东省公益研究与能力建设专项资金项目 (2014A020208094;2015A020209102);华南农业大学人才引进启动项目(k13009)

收稿日期：2016-02-17