应用物种DNA条形码识别太湖流域部分底栖无脊椎动物种类

张翔，张效伟，杨江华，周国栋

(1. 南京大学环境学院，江苏 南京 210000；2. 江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室，江苏 常州 213001；3. 常州市环境监测中心，江苏 常州 213001)

应用物种DNA条形码识别太湖流域部分底栖无脊椎动物种类

张翔1，2，3，张效伟1*，杨江华1，周国栋2，3

(1. 南京大学环境学院，江苏 南京 210000；2. 江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室，江苏 常州 213001；3. 常州市环境监测中心，江苏 常州 213001)

将物种DNA条形码实际应用于太湖流域底栖无脊椎动物分类，并与形态学分类结果比对，结果表明，DNA条形码技术可应用于本流域底栖无脊椎动物分类，但现阶段无法替代形态学鉴定，主要原因是太湖流域底栖无脊椎动物的绝大多数物种COⅠ基因特征序列是未知的或是BLAST所拥有的分类程度不够，提出在今后的研究中应探索建立太湖流域底栖无脊椎动物COⅠ基因数据库。

太湖流域；底栖无脊椎动物；DNA条形码；形态学分类

底栖无脊椎动物作为常用的水质指示生物之一[1]，因传统形态学分类鉴定的局限和传统分类学家队伍的缩减[2]，使得其用作水质生物生态监测与评价的推广有一定难度。2009年，第57届北美底栖生物学协会(NABS)年度会议中总结了DNA条形码技术对底栖生物研究的贡献，并在底栖生物科学家之中进行推广，使该技术得到大面积的使用[3]。在我国，目前该技术以植物、昆虫和水生动物的研究为主流[4]，在水生动物研究中，尤以海洋动物为主[5]。在淡水底栖无脊椎动物方面，除水生昆虫外，国内研究报道较少，但甲壳动物和软体动物均有所涉及：2006年杨学明等[6]对罗氏沼虾3个群体线粒体COⅠ基因的序列差异和遗传标记进行研究报道；2007年关飞等[7]对中国不同种拟钉螺COⅠ基因的序列差异及其系统学进行研究报道；2008年黄晓燕等[8]对5种螺蛳属动物和中国圆田螺COⅠ基因序列进行研究报道；2012年焦明超[9]对环棱螺属部分种类DNA条形码及其系统发育进行研究报道；2015年欧阳解秀等[10]应用DNA条形码技术对鄱阳湖和赣江的中国淡水蚌类进行研究报道。

现尝试选取太湖流域最具代表性的底栖无脊椎动物，使用DNA条形码技术分析COⅠ基因，并与传统形态学鉴定结果比较，探索DNA条形码技术应用于本流域底栖无脊椎动物鉴定的可行性和实用性，为推进淡水生物监测方法做出探索。

1 材料与方法

1.1 样品材料

1.1.1 样品采集

按照《水和废水监测分析方法》(第四版)5.1.3的要求，于2013年8月—2014年5月在太湖流域采集样品，点位包括太湖流域上游水系的溪流与水库，下游水系的湖荡与河流，共10个代表点位，见图1。

图1 样品采集点位

1.1.2 样品鉴定和保存

样品采集、挑拣后固定于80%乙醇溶液中，在实验室进行形态学分类鉴定，鉴定完成后将已鉴定样品置于99.99%乙醇溶液中保存。

1.2 实验方法

1.2.1 形态学解剖选取

在鉴定后保存的样品中挑选个体完整度高，动物体表无大量杂质的个体，用Nikon SMZ18研究级体视显微镜拍照留存图像资料。使用无菌剪、无菌手术刀片获取动物组织：昆虫、甲壳动物取足部，环节动物、软体动物、扁形动物取身体软组织(避开消化道)，如个体实在太小(如部分摇蚊幼虫)，则选取完整个体，用纯水和75%乙醇溶液分别清洗取出的身体组织约0.005 0 g，保证无杂质、无污染。

1.2.2 DNA提取

研究使用一种改良的HotSHOT[11]快速方法：取得的动物组织装入洁净的玻璃十字柄组织研磨器中加入10 μL碱性裂解液(NaOH 25 mmol/L、EDTA二钠0.2 mmol/L，pH值=8.0)研磨，将研磨所得液体加入0.2 mL离心管中，再添加20 μL碱性裂解液。离心管均在95 ℃孵育30 min，并贮存于冰上3～5 min。每根离心管加入30 μL Neutralizing Buffer缓冲液[12]，离心后取上清液。

1.2.3 PCR扩增与产物电泳

PCR扩增体系最终体积为50 μL，其中包括引物1 μL，浓度为10 μmol/L ，超纯水37.8 μL，10×PCR High Fidelity PCR buffer 5 μL，50 mmol/L MgSO42 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，Platinum Taq DNA聚合酶 0.2 μL，DNA模板2 μL。引物见表1。

表1 引物

将装有样品的96孔板置于SureCycler 8800热循环仪中进行PCR反应，为降低非特异性扩增率，进行了16个初始周期如下：95 ℃ 10 s变性、62 ℃(每个周期降低1 ℃)30 s退火，72 ℃ 60 s延伸，25个循环退火至46 ℃；72 ℃ 10 min后延伸。实验包含一个不含DNA模板的阴性对照。

1.2.4 基因序列测定

为保证每个样品测序均匀，扩增产物在等分子质量、等质量浓度(10 mg/L)条件下混合。使用Ion Plus fragment library kit试剂盒将100 ng的扩增产物在79 μL无核酸酶水中进行末端修饰和片段衔接。用Agencourt AMPure XP kit试剂盒，纯化末端和衔接片段DNA、去除引物二聚体和小于100 bp的PCR产物。纯化后的扩增产物库转移至新的1.5 mL Eppendorf LoBind管中，用Agilent 2100 bioanalyzer仪器检测其DNA浓度和分布区域。

将已定量且大小适中的扩增产物库(467 bp， 包括扩增引物，MID标签，Ion Torrent衔接片段)连续稀释至终浓度为26 pmol/L，用Ion PGM template OT2 400 kit试剂盒附加到 ISPs表面。ISPs在Ion OneTouch富集体系中富集，使用Ion PGM sequencing 400 kit试剂盒、Ion Torrent PGM试剂盒、“318 v2”微型芯片测序。本研究测序交由Life technologies 中国公司于上海完成。

1.2.5 基因序列分析

用Bio-Linux 8系统处理所得到的基因序列，去除低质量的末端序列与引物序列，并进行序列组装，将组装完成的序列保存为.fasta格式；使用R语言软件中“Biostrings”软件包和“Bioconductor environment ”组件去除少于150 bp的片段，同时由于COⅠ基因片段在氨基酸水平上高度保守，故未正确编码氨基酸的非功能性序列也被去除。

在NCBI(美国国立生物技术信息中心)GenBank进行在线BLAST比对。剔除BLAST后比对出的同一样品中序列极少的DNA片段。将样品名称、图片资料和BLAST后获得的物种比对分析、保存。

2 结果分析

2.1 样品分类

共选取13个底栖无脊椎动物种类，制成13×2份动物样品，供COⅠ基因提取(表2)。

2.2 基因组测序及在线BLAST结果

使用新一代DNA条形码技术测定基因组，共获取98条COⅠ基因序列。经分析软件去除杂带和引物，剩下的核苷酸片段长度为15～2 761 bp。在13个物种中均获得基因序列，10个物种的基因序列为有价值基因序列(表3)。

表3 不同物种在线BLAST结果

续表

①比对获得的基因序列长度<200 bp，因可信度不高，不进行DNA条形码技术与形态学鉴定比对。

2.3 DNA条形码技术与形态学鉴定比对

研究表明，用DNA条形码技术与形态学鉴定均可对同一样品进行分辨，但各有优劣，其中：DNA条形码技术鉴定样品有4个与形态学鉴定样品相同，可修正和细化4个形态学鉴定样品，有1个分类程度不如形态学鉴定样品，有1个样品存疑(表4)。

表4 DNA条形码技术识别与形态学鉴定结果比对

续表

(1)复检A84号样品，背瘤丽蚌与洞穴丽蚌同属小方蚌亚科(Ambleminae)丽蚌属(Lamprotula)，且为姐妹种[14]，洞穴丽蚌为我国特有种。在本实验中因DNA条形码识别相似度为100%，故予以更改形态学鉴定结果。形态学鉴定关键为对洞穴丽蚌的洞穴判定：两壳面对应的凹凸，即在一壳为凹，另一壳相应位置为凸。但在实际操作中，因其深、浅情况个体间差异大，故辨识较困难[15]，而使鉴定出现一些偏差；

(2)复检A10号样品，软铗小摇蚊与多巴小摇蚊同属于摇蚊亚科(Chironominae)摇蚊族(Chironomini)小摇蚊属(Microchironomus)，其中多巴小摇蚊2006年由闫春财等[16]于中国首次记录，软铗小摇蚊为世界广布种，在本实验中因DNA条形码识别相似度为98.65%，故予以更改形态学鉴定结果。首先确定A10号样品与上传至NCBI GenBank的物种样品为同一物种，但复检后发现形态学鉴定关键描述仍存在一定的模糊，并未制作翔实的检索表，在今后可予以完善；

(3)复检A34号样品，蠓科一种与摇蚊科一种两科同属于昆虫纲(Insecta)双翅目(Diptera)，经检索资料[17]及参考样品查找，形态学鉴定应无错，故此处存疑；

(4)复检A53号样品，形态学鉴定的扁(舌)蛭科一种分类程度包含了白舌蛭，但形态学鉴定人员水平所限，DNA条形码细化了分类程度，查阅相关资料后采纳DNA条形码技术提供的细化结果；

(5)复检A25号样品，霍普水丝蚓属于寡毛纲一种，DNA条形码识别因受制于本流域底栖无脊椎动物COⅠ基因库不完善，故分类程度不如形态学鉴定，因此DNA条形码识别需细化；

(6)复检A81号样品，方形环棱螺与铜锈环棱螺同为环棱螺属(Bellamya)，在样品固定后，形态学鉴定仅能依据体螺层的膨胀度来判别，因描述抽象且鉴定人员水平所限，在实际工作中常有混淆，DNA条形码在基因层面上提供了识别条件[9]，故采纳DNA条形码技术提供的结果。

3 讨论与展望

研究表明DNA条形码技术可应用于太湖流域底栖无脊椎动物鉴定。但现阶段无法替代形态学鉴定，主要原因是太湖流域底栖无脊椎动物绝大多数物种的COⅠ基因特征序列是未知的或是BLAST所拥有的分类程度不够，故将在今后的研究中探索建立太湖流域底栖无脊椎动物COⅠ基因数据库。

DNA条形码技术可以鉴定已知物种，识别未知物种，发现目前形态学鉴定物种出现的模糊区域，但不应完全取代形态学鉴定[18]。因为在实际应用中会遇到一些问题：

(1)对于未知物种只能识别，无法精确鉴定其分类地位；

(2)无法明晰物种存活与否，因为太湖流域生物所受环境变化影响剧烈，物种演替变化较快，使用DNA条形码技术鉴定采样点位物种时，会因生物死亡未分解而残留该生物DNA，使得鉴定数据杂糅，不能很好地支撑生态评估和政策决断；

(3)太湖流域底栖无脊椎动物COⅠ基因数据库尚未建立，且之前所有结果均依赖于形态学鉴定，如何得到精准而有延续的数据也是在将来需要探讨的。因为从实验室到业务工作均要求更准确、实用的数据，所以将来应将形态学鉴定与DNA条形码技术互相结合，获得两者印证的结论再予以使用。

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栏目编辑 周立平

Applying DNA Barcoding for Identification of Some Invertebrate Macrozoobenthos at Taihu Lake Basin

ZHANG Xiang1，2，3，ZHANG Xiao-wei1*， YANG Jiang-hua1，ZHOU Guo-dong2，3

(1.SchoolofEnvironment，NanjingUniversity，Nanjing，Jiangsu210000，China； 2.JiangsuEnvironmentalProtectionKeyLaboratoryforAquaticBiomonitoring，Changzhou，Jiangsu213001，China； 3.ChangzhouEnvironmentalMonitoringCenter，Changzhou，Jiangsu213001，China)

DNA barcoding was applied for identification of invertebrate macrozoobenthos at Taihu Lake basin and the results were compared with those obtained from morphological classification. The results demonstrated that DNA barcoding could be applied to classify invertebrate macrozoobenthos at the basin， but at this stage could not replace morphological classification. The main reason was that there were unknown COI characteristic gene sequences for most of the invertebrate macrozoobenthos species or that the degree of classification was not enough for BLAST. It was proposed to explore and establish the gene data bank for invertebrate macrozoobenthos at Taihu Lake basin in future studies.

Taihu Lake basin； Invertebrate macrozoobenthos； DNA barcoding；Morphological classification

2016-03-17；

2016-03-25

国家水体污染控制与治理科技重大专项基金资助项目(2012ZX07506-003)

张翔(1985—)，男，工程师， 本科，从事水生生物学监测工作。

X835

B

1674-6732(2016)06-0018-04