恩再适对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及机制研究

胡 睿，孙梦婕，秦 颖，肖 智

(1.遵义医学院 研究生学院，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

恩再适对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及机制研究

胡 睿1，孙梦婕1，秦 颖2，肖 智2

(1.遵义医学院 研究生学院，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

目的 观察恩再适(analgecine)对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用以及对中脑导水管周围灰质外侧区(lPAG)P2X7受体表达的影响，明确恩再适对神经病理性疼痛大鼠镇痛的初步机制。方法 建立SD大鼠坐骨神经慢性压榨性损伤(CCI)模型；通过在外周受损神经周围注射不同剂量恩再适后观察其对CCI大鼠机械痛阈值(MWT)和lPAG中P2X7受体表达的影响；CCI大鼠lPAG微量注射P2X7受体拮抗剂A-740003对恩再适镇痛作用的影响。结果 CCI大鼠经多次外周注射恩再适后，大鼠机械痛阈值逐渐增高(P<0.001)，说明局部注射恩再适对CCI大鼠具有镇痛作用；CCI大鼠外周注射恩再适后，lPAG中P2X7受体表达上调(P<0.001)，其上调幅度与注射恩再适剂量相关。另取建模后14 d经多次外周注射恩再适的CCI大鼠，观察发现：大鼠lPAG微量注射P2X7受体拮抗剂A-740003可削弱外周注射恩再适的镇痛作用。结论 恩再适对神经病理性疼痛大鼠有镇痛作用，其机制与促进lPAG中P2X7受体激活有关。

恩再适；神经病理性疼痛；中脑导水管周围灰质；P2X7受体

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是一种慢性持续性疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉过敏或超敏、感觉异常等。目前临床治疗神经病理性疼痛的方法较多，最主要的仍以药物治疗为主，常用的镇痛药物有阿片类药物、非甾体类药物、三环类抗抑郁药物、抗癫痫药物、钙通道阻断剂等，然而这些药物疗效不一，并且具有不同程度的副作用，在临床上限制了其使用范围，因此，临床致力寻找镇痛效果好且副作用小，安全的镇痛新药。

近年来，牛痘疫苗接种家兔炎症皮肤提取物[包括神经妥乐平(neurotropin)和恩再适(analgecine)]越来越广泛地应用于神经病理性疼痛的临床镇痛治疗。它是在健康家兔皮内接种人用牛痘病毒活疫苗，经过炎性反应和免疫反应产生的非蛋白小分子生物活性物质。牛痘疫苗致炎兔皮提取物是一种具有神经亲和性的生物制剂，研究提示其主要作用机制是调节神经-免疫-内分泌系统的调节功能。

中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)是机体内源性镇痛系统的关键部位，特别是其外侧区(lateral periaqueductal gray，lPAG)，在疼痛形成和维持机制中均有重要作用[1]。5'-三磷酸腺苷(adenosine-5'-triphosphate，ATP)是一种快速的神经递质和神经胶质递质，参与机体多种生理及病理功能的调节。ATP受体分为P1(腺苷)和P2(嘌呤)两类受体，ATP及其受体参与了疼痛信息的传导和调制[2-3]。P2X7受体是P2X家族中一个独特的亚型，属于配体门控的阳离子通道，在中枢神经元和神经胶质细胞均有表达。近年P2X7受体在疼痛形成和维持机制中的作用成为疼痛研究的热点之一。

对于牛痘疫苗致炎兔皮提取物的镇痛机制中是否有lPAG中P2X7受体的介入未见文献报导，因此，探讨牛痘疫苗致炎兔皮提取物的镇痛机制与lPAG中P2X7受体的关系是本研究的主要目的。本实验将建立慢性神经压榨性损伤(chronic constriction injury，CCI)所致的神经病理性疼痛大鼠模型，通过在受损的坐骨神经旁多次注射不同剂量恩再适，观察恩再适是否对神经病理性疼痛大鼠具有镇痛作用并探讨其镇痛机制是否有lPAG中P2X7受体的介入。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共108只购于重庆第三军医大学，许可证号：SCXK(渝)2012-0005。体重210～220 g，实验期间分笼饲养，3～4只大鼠1笼；大鼠置于安静，温度(24±1)℃，湿度(60±5)%，人工光照，明暗各12 h/d(8AM～8PM)周期的环境中饲养，自由进食及饮水。本研究严格按照国际疼痛研究协会(International Association for the Study of Pain，IASP)关于应用动物进行疼痛研究的伦理纲要进行操作，实验过程中尽量减少动物的不适和动物的使用量。

按照随机数字表法将84只大鼠随机分为7组(n=12)：正常组(normal组)、假CCI组(Sham-CCI组)、CCI组(CCI组)、CCI+生理盐水组(CCI+NS组)、CCI+低剂量恩再适组(CCI+Low analgecine组)、CCI+中剂量恩再适组(CCI+Middle analgecine组)、CCI+高剂量恩再适组(CCI+High analgecine组)。CCI+NS组大鼠在损伤的坐骨神经局部注射生理盐水；CCI+低、中、高剂量恩再适组分别在损伤的坐骨神经局部注射不同剂量(0.12、0.24、0.48 单位/0.4 mL)恩再适；在CCI手术后14 d每组取6只用于免疫组化检测P2X7受体在lPAG中的表达，剩余6只观察MWT值变化情况，直到CCI术后21 d。正常组不做任何处理，仅做对照。

另取SD大鼠24只建立CCI模型，按照随机数字表法分为3组(n=8)：CCI组、CCI+analgecine组和CCI+A-740003+analgecine组。观察lPAG内微量注射A-740003对恩再适镇痛作用的影响。

1.2 主要实验仪器及试剂 电子VonFrey测痛仪(IITC Life science公司，2390系列，美国)、冰冻切片机(Leica CM1950，德国)、脑立体定位仪(Narishige公司，SR-6R，日本)、兔抗大鼠P2X7多克隆抗体(abcam公司，美国)、兔超敏二步法检测试剂盒( PV-6001，北京中杉金桥生物技术有限公司)、新生牛血清[平睿生物科技(北京)有限公司]、浓缩型DAB显色试剂盒(ZLI-9301，北京中杉金桥生物有限公司)、恩再适(3.6单位/3 mL/支，威世药业，江苏)、A-740003(Tcris公司，英国)：溶于1%二甲基亚砜(dimethylsurferide,DMSO)，分装后-20 ℃保存，lPAG微量注射前用生理盐水稀释至所需浓度，每次微量注射含100 nmol A-740003的生理盐水0.5 μL。

1.3 动物模型建立 参照Bennett等[4]的方法制备大鼠坐骨神经慢性压榨性损伤(CCI)模型。大鼠予以4%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后，于右后腿纵向切开皮肤，钝性分离，暴露坐骨神经主干，4-0丝线间断结扎，间距1 mm，结扎强度以小腿肌肉轻微震颤为度。生理盐水冲洗后逐层缝合。术后单笼饲养，麻醉清醒后自由摄食及饮水。假手术组仅暴露坐骨神经不进行结扎，余同模型组。

1.4 坐骨神经旁注射 CCI建模成功后第7天，CCI+Low analgecine组、CCI+Middle analgecine 组和CCI+High analgecine组大鼠每组取6只，分别抽取0.12、0.24、0.48 单位/0.4 mL的恩再适注射液注射于大鼠损伤坐骨神经旁，1 次/d，共注射7次，连续7 d。CCI+NS组大鼠在坐骨神经周围注入0.4 mL等量的NS，其余操作同前3组。注射部位定位方法：参照刘永峰等[5]的方法，在大鼠股骨大转子和坐骨结节间皮肤进针后向前内侧前进，沿着坐骨神经走行呈扇形注射药液。

1.5 机械痛阈值的检测 测定机械痛阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)时，室温维持在20～24 ℃，保持周围环境安静。先将大鼠置于底带孔的透明有机玻璃笼中30 min，使大鼠适应环境，待大鼠停止行走、抓挠、直立、排便等活动处于安静状态后开始检测。通过网孔用电子vonFrey纤维刺激大鼠后肢足底中部2 s，出现缩足反应时读数为MWT值。建模(CCI)前(0 d)和建模后1、3、5、7、9、12、14、18、21 d分别检测大鼠MWT值。

1.6 中脑导水管周围灰质植管及微量注射 CCI+A-740003+analgecine组大鼠于CCI术后第9天给予4%水合氯醛腹腔麻醉(10 mL/kg)，麻醉成功后，大鼠俯卧位置于脑立体定位仪上，切开头皮，暴露颅骨，钻孔，在lPAG植管。lPAG的坐标为：前囟后7.80 mm，中线旁开0.60 mm，颅骨表面下4.5 mm。插入外直径(o.d.)0.8 mm插管，用牙科磷酸锌水门钉固定，在插管内放入一内芯，防止插管堵塞。植管后给予青霉素钠盐(溶于2 mL无菌盐水)腹腔注射预防感染。手术结束后放入笼中，保温直到麻醉苏醒。插管完成后，每日观察大鼠的一般情况，生命体征以及运动功能变化，如果出现神经系统功能障碍(瘫痪、呼吸异常、插管脑脊液漏等)，排除在实验组外。lPAG植管后5 d给予微量注射P2X7受体特异性拮抗剂A-740003，注射药物前轻度固定大鼠，用微量进样器连接注射针头后给予注射，注射针头长于导管1 mm。每次注射100 nmol/0.5 μL，3 min内注射完毕，留针2 min，确保药物的完全扩散。整个实验结束时，通过微量进样器注入2%伊文思蓝 0.2 μL，确定注射部位并与大鼠脑图谱[6]比对，只有注射部位位于lPAG的大鼠数据才纳入统计处理。

1.7 免疫组化 大鼠腹腔注射过量4%水合氯醛(20 mL/kg)。待大鼠肢体松弛，翻正反射消失后，迅速开胸，暴露心脏，灌注针经心尖插至主动脉升部，予150 mL预冷的生理盐水快速灌注，然后予4%多聚甲醛250 mL持续2～3 h缓慢灌注。断头取脑，4%多聚甲醛溶液固定6 h后转移至30%蔗糖溶液(4 ℃)中脱水。脑组织沉底后取出，冰冻包埋剂(OCT)包埋后-20 ℃冰冻切片机中速冻30 min，沿冠状位连续切片，厚25 μm，每5～6张PAG切片取1张，每只大鼠取10张进行免疫组化分析。免疫组织化学染色步骤：3%过氧化氢溶液室温封闭40 min；正常牛血清室温封闭1 h；加一抗：兔抗大鼠P2X7(1∶400)，37 ℃孵育1 h后转移到4 ℃冰箱过夜；按说明加入兔超敏二步法检测试剂，37 ℃孵育20 min；DAB显色2～5 min，明胶贴片；自然风干后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；封固后在光镜下观察并采集图像。在切片放大200倍条件下，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对lPAG的阳性图片进行阳性细胞计数。lPAG中细胞有细胞核、一个完整的胞体和细胞边界算做1个细胞。计数每个视野中的细胞数，每张计数5个不重叠的视野，取均值。

2 结果

2.1 CCI大鼠疼痛行为学变化 大鼠CCI术后健康状况良好，体重无明显减轻，毛色有光泽，饮食正常。术侧足趾展开且轻度外翻，常抬起并贴于腹部；站立时以左后足持重；右足行走无力，呈跛行状态。常将右后肢抬起，有时出现舔舐、抓挠等，无自噬现象。正常组和假手术组未出现肢体畸形及活动异常现象。

2.2 大鼠机械痛阈值变化 CCI术后大鼠建模侧(右侧)后肢MWT值逐渐下降，在CCI手术后14 d达到最低值，与正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.001)；其后MWT值逐渐上升，在CCI术后21 d，与正常组比较，差异仍有统计学意义(P<0.001)；外周损伤神经周围注射不同剂量的恩再适后，CCI大鼠MWT值升高，各观察时间点与CCI组大鼠比较，差异均有统计学意义(P<0.001)，且MWT升高值与恩再适注射剂量呈正相关，说明局部注射恩再适对CCI大鼠有镇痛作用。假手术组大鼠MWT值在各观察时间点与正常组大鼠比较，差异无统计学意义；CCI+NS组大鼠MWT值在各观察时间点与CCI组大鼠比较，差异无统计学意义(见图1)。

*P<0.001，与同时间点Control组(正常组)大鼠比较；#P<0.001，与同时间点CCI组大鼠比较；△P<0.001，与同时间点CCI+Low analgecine组大鼠比较；▲P<0.001，与同时间点CCI+Middle analgecine组大鼠比较。图1 各观察时间点大鼠机械痛阈变化曲线

2.3 lPAG中P2X7受体表达变化 取CCI手术后14 d各组大鼠(n=6)，免疫组化染色提示：P2X7受体表达于IPAG神经元胞浆，正常组和假手术组大鼠在lPAG中仅有少量P2X7受体阳性细胞表达，差异无统计学意义。CCI组大鼠lPAG中P2X7受体表达增加，与正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.01) ；外周损伤神经周围注射恩再适后，P2X7受体表达进一步上调，与CCI 组比较，差异有统计学意义(P<0.001)，且随着注射恩再适剂量的增加，lPAG中P2X7受体的表达量增加；CCI +NS组大鼠lPAG中P2X7受体的表达与CCI组大鼠比较，差异无统计学意义。说明外周局部注射恩再适可促进CCI大鼠lPAG中P2X7受体表达(见图2A，2B)。

图2A：各组同时间点大鼠lPAG中P2X7受体免疫组化阳性细胞图；图2B：P2X7受体阳性细胞计数。a：Control组；b：Sham-CCI组；c：CCI组；d：CCI+Low analgecine组；e：CCI+Middle analgecine组；f：CCI+High analgecine组；g：CCI+NS组。*P<0.01，与同时间点正常组大鼠比较；#P<0.001，与同时间点CCI组大鼠比较；△P<0.001，与同时间点CCI+Low analgecine组大鼠比较；▲P<0.001，与同时间点CCI+Middle analgecine组大鼠比较。图2 CCI手术或恩再适注射后大鼠lPAG中P2X7受体表达的影响

2.4 lPAG微量注射A-740003对恩再适镇痛作用的影响 取CCI建模后7 d大鼠，分为CCI组、CCI+analgecine组和CCI+A-740003+analgecine组(n=8)。CCI+analgecine组和CCI+A-740003+analgecine组于CCI建模7 d后分别给予0.48 单位/0.4 mL的恩再适注射于大鼠损伤坐骨神经旁，1 次/d，共注射7次，连续7 d。在CCI手术后第14天，CCI+analgecine组大鼠坐骨神经旁注射恩再适，MWT值在注射后10 min升高到最大值，此后在观察时间内(30 min)，MWT值无明显变化；CCI+A-740003+analgecine组大鼠给予lPAG中微量注射P2X7受体拮抗剂A-740003(100 nmol/0.5 μL)5 min后，外周坐骨神经周围再给予0.48 单位/0.4 mL恩再适注射。观察发现CCI+A-740003+analgecine组大鼠恩再适注射后10 min，MWT值上升达到最大值，与CCI组大鼠比较，差异有统计学意义(P<0.001)；CCI+A-740003+analgecine组大鼠与CCI+analgecine组大鼠比较其MWT值上升幅度减小，差异具有统计学意义(P<0.001)。CCI+A-740003+analgecine组大鼠随后MWT值逐渐下降，在恩再适注射后30 min，其MWT值与CCI组大鼠比较，差异无统计学意义(见图3)。

*P<0.001，与CCI组大鼠比较；#P<0.001，与CCI+A-740003+analgecine组大鼠比较。图3 A-740003预处理对恩再适镇痛作用的影响

3 讨论

神经病理性疼痛是神经系统原发性损害和/或功能障碍引起的疼痛，临床常见的神经病理性疼痛有糖尿病神经性疼痛、三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、恶性肿瘤或肿瘤治疗后引起的神经性疼痛等，严重影响患者的工作学习及生活质量。牛痘疫苗接种家兔炎症皮肤提取物用于治疗神经病理性疼痛在临床上得到广泛的应用，目前研究显示牛痘疫苗致炎兔皮提取物主要有以下几方面作用：①神经修复及神经营养；②镇痛；③改善冷感、麻木等神经症状；④免疫调节等。Masuguchi等[7]研究显示神经妥乐平可以缓解化疗药物-奥沙利铂(oxaliplatin，L-OHP)引起的神经病变，并通过激活Gi蛋白偶联受体调控下行疼痛抑制系统发挥镇痛作用。Okai等[8]采用在体细胞膜片钳技术证实神经妥乐平可以直接激活蓝斑(locus coeruleus，LC)去甲肾上腺素能神经元，通过下行性疼痛抑制系统抑制脊髓背角神经元活动，缓解神经病理性疼痛。Ryohei等[9]在研究神经妥乐平的作用机制中还发现，在L5脊神经结扎(spinal nerve ligation，SNL)的神经病理性疼痛大鼠模型中，静脉给药或侧脑室注射神经妥乐平均可有效治疗疼痛，而外周足垫注射给药不能止痛，这说明神经妥乐平的镇痛机制在中枢脊髓以上的结构，而不是在外周。在本研究中，神经病理性疼痛大鼠(CCI大鼠)外周损伤神经周围多次给予恩再适后，大鼠机械痛阈值上升，疼痛症状缓解，我们考虑其镇痛机制可能是局部注射恩再适对损伤的坐骨神经具有修复和营养作用。该结论还需对损伤神经做病理学和电生理学的进一步研究。

P2X7受体是P2X家族中一个独特的亚型，属于配体门控的阳离子通道。在中枢神经系统中，P2X7受体表达神经元和神经胶质细胞，包括：星形胶质细胞和小胶质细胞。P2X7受体被ATP及其类似物激活后引起K+、Na+、Ca2+等阳离子跨膜运动，对二价阳离子表现出相对较强的选择性；同时，P2X7受体与其它P2X受体比较，其分子结构有特殊性，表现为在二价阳离子或ATP的持续刺激下，激活的P2X7受体分子构象出现变化，即快速由直径0.8～1.1 nm的离子通道转化为直径3～5 nm的“膜孔”，该孔道可对分子量较大的物质进行通透[10]。近年研究发现，P2X7受体活化后引起Ca2+内流，细胞内Ca2+水平升高，进而激活下游多种信号转导途径产生不同生理或病理效应。Chassell等[11]的研究显示，P2X7受体基因缺失小鼠，其机械痛敏及热痛敏均未能出现，其IL-1β释放减少，提示P2X7受体在外周神经损伤引起的神经病理性疼痛中扮演着非常重要的角色。Chu等[12]的研究显示大鼠给予强直刺激坐骨神经后脊髓背角小胶质细胞P2X7受体水平显著升高，应用siRNA抑制或P2X7受体拮抗剂BBG或oxATP后，可明显阻断坐骨神经强直刺激诱发的脊髓C纤维场电位的长时程增强(long term potentiation，LTP)，并可缓解机械性痛觉超敏。Jiang等[13]研究发现，CCI大鼠模型建立后，机械痛阈值和热痛阈值下降，术后3 d脊髓背角小胶质细胞P2X7受体表达迅速上调，利鲁唑可通过抑制小胶质细胞激活下调P2X7受体表达，降低炎性细胞因子MAPK信号通路的激活，缓解CCI大鼠的疼痛。

PAG是机体疼痛调制的关键部位，多种神经递质、神经调质以及受体等参与PAG对疼痛信息的处理。本研究发现：正常组大鼠lPAG中仅有少量P2X7受体阳性表达；CCI术后大鼠lPAG中P2X7受体表达上调，考虑为CCI手术引起的疼痛信息上传后激活机体的内源性镇痛系统，引起lPAG中P2X7受体表达量增多；外周损伤给予多次恩再适局部注射后，CCI大鼠机械痛阈值显著升高，且P2X7受体在lPAG的阳性表达进一步增加，并与恩再适剂量呈正相关，说明外周局部注射恩再适可以促进CCI大鼠lPAG中P2X7受体的表达。A-740003是目前最常使用的P2X7受体拮抗剂，具有高效、高选择性及高安全性的特点。研究发现，nmol浓度的A-740003即可抑制大鼠和人P2X7受体的功能。本研究也发现，预先在lPAG中微量注射P2X7受体特异性拮抗剂A-740003后，可以部分翻转恩再适的镇痛作用，说明恩再适通过激活lPAG中P2X7受体，加强机体的内源性镇痛系统作用，进而对CCI大鼠产生镇痛作用。对于外周注射恩再适引起lPAG中P2X7受体表达增加的具体机制仍需进一步探索明确。

综上所述，通过本研究，可认为注射恩再适能有效缓解CCI大鼠的疼痛，为临床应用牛痘疫苗致炎兔皮提取物治疗神经病理性疼痛提供了新的理论依据。

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收稿2016-10-05;修回2016-11-15〗

(编辑：王静)

Analgesic effect of analgecine on neuropathic pain in rats and the possible mechanisms

HuRui1,SunMengjie1,QinYing2,XiaoZhi2

(1.Graduate School,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Research Center for Medicine & Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the analgesic effect of analgecine on expression changes of P2X7receptor in the lateral midbrain periaqueductal gray (lPAG) of rat model of neuropathic pain,and to examine its mechanisms.Methods Using adult male Sprague Dawley (SD) rats for the establishment of the sciatic nerve chronic constriction injury (CCI) model,followed by injections of different doses of analgecine around the injured sciatic nerve.Changes of the mechanical withdrawal threshold (MWT) values and the expression alterations of P2X7receptor in the lPAG of the experimental rats were examined.The effect of intra-lPAG injection of A-740003,a selective antagonist of P2X7receptor,on the analgesic effect of analgecine was also detected.Results The MWT values increased (P<0.001vscontrol and Sham-CCI) and the expressions of P2X7receptor in the lPAG were up-regulated dose-dependently after multiple injections of analgecine on the CCI rats (P<0.001vscontrol and Sham-CCI).Intra-lPAG injection of A-740003 partially but significantly reversed the analgesic effect of analgecine.Conclusion The injured-nerve local injections of analgecine can increase the MWT values of neuropathic pain rats,which is associated with the activation of P2X7receptors in the lPAG.

analgecine; neuropathic pain; midbrain periaqueductal gray; P2X7receptor

遵义医学院博士科研启动资金资助项目(NO：F-799)。

肖智，男，博士，教授，研究方向：疼痛机制及调制，E-mail:xiaozhi1971@163.com。

R338.2

A

1000-2715(2016)06-0552-06