中药组方热水提取正丁醇相的HPLC-MS分析

杨　海，耿传信，周学锋，赵　峡，邹　晓

(1. 山东省青岛市中心医院，山东 青岛 266042；2. 中国海洋大学医药学院,山东 青岛 266003;3. 山东省青岛市肿瘤医院，山东 青岛 266042)



中药组方热水提取正丁醇相的HPLC-MS分析

杨海1,2，耿传信3，周学锋1，赵峡2，邹晓1

(1. 山东省青岛市中心医院，山东 青岛 266042；2. 中国海洋大学医药学院,山东 青岛 266003;3. 山东省青岛市肿瘤医院，山东 青岛 266042)

[摘要]目的分析中药组方水煎液正丁醇相的化学组分。方法采用高效液相色谱-质谱联用法，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱，流速为1 mL/min，ESI正离子模式进行质谱检测，分子量扫描范围为50～1 000 m/z。将检测分子量数据与数据库对比，对相似度得分在80以上的化合物进行文献及来源药材成分检索，鉴定化合物。结果共鉴定巫山淫羊藿黄酮甙、淫羊藿属甙C、脱水淫羊藿素-3-鼠李糖甙、2-甲基-5-丙酮基-7-羟基色酮等16个化合物，并对化合物的药材来源进行归属。结论高效液相色谱-质谱联用技术为中药组方的成分鉴定提供了一种高效快速的方法，为中药组方的临床应用提供了理论依据。

[关键词]中药组方；水提取；正丁醇相；质谱分析

中药复方是中药临床应用的主要形式，中药物质基础研究是中药现代化的基础，对于阐明中药有效成分及其药理作用意义重大[1-2]。建立快速高效的中药组方成分分析方法，进而确定有效成分的协同作用是中药研究的方向之一[3]。近年来由于液质联用技术分析高效性、检测灵敏性等特点，使得该技术在中药组方中研究越来越广。本研究对临床应用多年且疗效确切的一组中药验方采用HPLC-MS法进行成分鉴定，旨在为该组方的临床使用提供理论依据和参考。

1实验资料

1.1仪器与试药液质联用色谱仪采用Agilent 1260 Infinity液相色谱系统，Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 质谱分析仪，安装Agilent Masshunter软件工作站；色谱柱采用Agilent Zorbox SB-C18(4.6mm×150 mm,5 μm)；R-410型旋转蒸发仪(瑞士Büchi公司)；DL-5低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；超纯水仪(美国Milli-Q公司)；DZF-150型数显小型恒温真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)；SEC20/3+1型常温二煎煎药机(黄冈永安医疗器械有限公司)。供实验用药材均采购自芍花堂药业股份有限公司，经青岛市中心医院主管中药师赵海鉴定；甲醇(色谱级，美国ACS公司)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂均为国产分析纯。0.22 μm微孔滤膜(上海亚东核级树脂有限公司)。

1.2方法

1.2.1萃取按照中药传统水煎煮工艺进行中药方的提取。按组方放大20倍，取中药复方共3.6 kg，加水煎煮3次。第1次加10倍量水，提取2 h；第2次加8倍量水，提取1.5 h；第3次加6倍量水，提取1 h。煎煮液过滤，合并，减压浓缩至浓缩液2.5 L左右。浓缩液依次用等体积的石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取3次，各相萃取液减压浓缩干燥。选取正丁醇相进一步实验。

1.2.2分析方法色谱条件：流动相为甲醇(A)-水(B)溶液；洗脱梯度：5%A(0～5 min)，5%～90%A(5～50 min)，90%A(50～51 min)；流速 1 mL/min；柱温40 ℃；自动进样1 μL。质谱条件：ESI正离子模式，分子量扫描范围50～1 000 m/z，载气流速12 L/min，载气温度：350 ℃，喷雾器压力35 psi。

2结果

按“1.2.2”项下色谱及质谱条件所得的中药方正丁醇相的总离子流色谱图见图1。将图1的m/z([M+H]+)数据与Aglient中药质谱数据库进行检索、对比，并通过查阅文献及单味药化学成分检索，共鉴定17个化合物，鉴定结果见表1。

注：1. 巫山淫羊藿黄酮甙(wushanicariin)；2. 淫羊藿属甙C(epimedoside C)；3. 脱水淫羊藿素-3-鼠李糖甙(anhydroicaritin-3-O-α-l-rhamnoside)；4. 2-甲基-5-丙酮基-7-羟基色酮(2-methyl-5-acetonyl-7-hydroxychromone)；5. 槲皮素(guercetol)；6. 4’-甲基茵陈色原酮(4’-methylcapillarisin)；7. 苍术内酯Ⅱ(atractylenolide II)；8. 苍术内酯I(atractylenolide I)；9. 龙葵螺甙B(uttronin B)；10. 茯苓新酸C(poricoicacid C)；11. 16α-羟基齿孔酸甲酯(tumulosicacidmethylester)；12. 掌叶大黄二蒽酮A(palmidin A)；13. 掌叶大黄二蒽酮B(palmidin B)；14. α-澳洲茄碱(α-solasonine)；15. β-澳洲茄边碱(β-solamargine)；16. 替告皂甙元(tigogenin)。

图1　中药组方正丁醇相总离子流(ESI阳离子模式)色谱图

3讨论

近年来从经典方剂、临床验方、名老中医优秀处方等挖掘新药、新组方是中药研发的主要策略之一。本研究的中药验方由山东省名老中医提供，临床应用多年。该组方由黄芪、白术、仙鹤草等11味中药组成，主要应用于恶性肿瘤患者，特别是免疫力低下肺癌、胃肠道恶性肿瘤中晚期患者，能提高患者免疫力，改善生活质量，联合放化疗能提高治疗依从性、减少放化疗不良反应，起到减毒增效的作用[4]。

中药组方药效发挥通常是通过多靶点、多途径协同作用[5-6]，对于整方的研究更能体现复方整体性及中医整体观理论，接近临床应用实际，因此本研究采用传统的水煎煮工艺，确保分析结果与药效相一致。由于中药成分的复杂性，为确保各组分有效分离，本研究采取甲醇-水梯度洗脱的方法，并适当延长洗脱时间。

在进行质谱分析时本研究采取ESI正离子模式，将所得的化合物精确分子量与数据库进行检索、对比，将相似度在80以上对比结果再次进行文献检索并将化合物的药材来源进行归属。同一精确荷质比(M/Z)可能对应多个药材来源不同化合物分子式，该方法难以鉴定，为此本研究在同一色谱条件下采取单药组分流出时间与组方成分流出时间对比的方式，从而可以确定成分的药材来源，进而确定结构。

总之，运用HPLC-MS法对中药组方成分鉴定，研究方法可行，为该组方活性研究及扩大临床应用提供数据支持，为发掘优秀中医处方提供方法学参考。

[参考文献]

[1]林丽美，王智民. 适宜于中医药特点的复方药效物质基础研究模式的探讨[J]. 中国中药杂志，2008，33(23)：2861-2864

[2]李小娜，张兰桐，殷玮. 中药复方药效物质基础研究途径与方法[J]. 中草药，2006，37(6)：801-806

[3]贾晓斌,陈彦,李霞,等. 中药复方物质基础研究新思路和方法[J]. 中华中医药杂志,2008,23(5):420-424

[4]耿传信，王晓璐，仇淑真，等. 解毒化瘀方治疗恶性肿瘤54例[J]. 中国药业，2015，16(6):72-73

[5]李元滨,林丽珠. 中药多靶点逆转肺癌多药耐药机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志,2014,20(8)：232-236

[6]杨义芳,萧伟. 基于多成分多靶点的中药药动/药效相关性研究解读与策略[J]. 中草药,2013,44(12)：1521-1528

[收稿日期]2015-07-10

[中图分类号]R284.2

[文献标识码]B

[文章编号]1008-8849(2016)04-0435-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.034

[基金项目]国家十二五科技支撑计划(2013BAB01B02)；青岛中医科研计划(2014-zyy022)

[通信作者]邹晓，E-mail：qdzx08@163.com