超声法提取对金针菇多糖抗氧化活性的影响

王文亮 弓志青 张圣杰 陈相艳 石贤权

摘要：本试验通过比较超声法提取与热水法提取的金针菇多糖的体外抗氧化活性，研究超声波提取对金针菇多糖抗氧化活性的影响。结果表明：在0.125-2.000mg/mL范围内，随金针菇多糖浓度的增加，其抗氧化能力增加；金针菇多糖对超氧阴离子的清除能力较强，对DPPH自由基的清除能力次之，对羟自由基的清除能力和相对还原力均较低。热水法与超声法提取的金针菇多糖抗氧化能力基本一致，即超声提取对金针菇多糖抗氧化活性几乎没有影响。

关键词：超声波提取；金针菇；多糖；抗氧化

中图分类号：S567.3+9

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）01-0054-04

金针菇（Flammulina velutipes）属真菌分类中的担子菌亚门伞菌目口蘑科小火焰菌属的真菌，又名冬菇、朴蕈等。金针菇多糖（FVP）是金针菇中重要的活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒和增强机体免疫力等功能。传统的水提醇沉法，提取时间长，提取率低，而超声波对植物细胞壁的破碎作用可提高提取得率，缩短提取时间。采用超声联合超微粉碎提取金针菇多糖时，其提取效率由热水提取的9%提高为20.5%。目前关于超声波提取对多糖结构和活性等方面的研究较少，王博等研究超声波强化提取对茯苓水溶性多糖结构的影响时，发现超声波提取会影响多糖的分子链结构，但不会影响多糖的单糖组成和单糖结构。廖建民等在研究超声波提取海带多糖时，发现超声波提取的多糖抑肿瘤效果与水提法无显著差异。本研究以Vc抗氧化能力做对照，通过比较热水提取与超声波提取对金针菇多糖的体外抗氧化活性，包括相对还原力以及对DPPH.、超氧阴离子、羟基自由基的清除作用的影响，研究超声波提取对金针菇多糖抗氧化性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

金针菇粉（100目），实验室自制，含水量5%。DPPH，购于Sigma公司，其余均为分析纯。

主要实验仪器：UV-6100紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；XO-SMlOO超声波微波组合反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；LXJ-IIB高速离心机：上海安亭科学仪器厂；DHG电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SY-2000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 金针菇多糖热水、超声波提取工艺 将金针菇粉按照优化后的提取工艺，即1∶25的料液比，加入热水9℃提取4h，或380W超声25min后，4500r/min离心20min，取上清液浓缩3倍，80%乙醇醇沉，离心，将沉淀物冻干得到两种不同提取方法的金针菇粗多糖，水提与超声波提取的提取率分别为9%、20%，采用苯酚一硫酸法测多糖含量。

将热水与超声法提取的金针菇多糖分别配成0.125、0.500、1.000、1.500、2.000mg/mL的多糖溶液，3000xg离心10min，取上清液备用。

1.2.2 金针菇多糖相对还原力测定参照Ovai-ZU[7]的方法。分别取多糖样品1.0mL于试管中，加入pH6.6的0.2mol/L磷酸盐缓冲液、1%的K₃[Fe（CN）₆]溶液各2.5mL，50℃水浴保持20min。冷却，再加入10%三氯乙酸2.5mL混匀，3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL水和0.1% FeCl₃溶液0.5mL，常温反应10min，测定A700nm，测定3次，取平均值。并以VC为对照比较两种方法提取的金针菇多糖的相对还原力。

1.2.3 金针菇多糖清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH.）的测定 DPPH·清除率（I1）按公式（1）计算，其中A1为1.0mL多糖溶液和4.0mL6.5×10^-5mol/L DPPH·、A₂为1.0mL50%乙醇溶液和4.0mL不同浓度的多糖液、A₃为1.0mL 50%乙醇溶液和4.0mL 6.5×10^-5mol/L DPPH·分别反应30min后在517nm处测得的吸光值；测定3次，取平均值。并以抗坏血酸为对照，比较两种方法提取金针菇多糖对DPPH·的清除率。

1.2.4 金针菇多糖对超氧阴离子的清除能力测定邻苯三酚自氧化速率的测定：将试管中加入4.5mL的50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值8.2）和4.2mL蒸馏水，25℃水浴20min，取出后迅速加入0.3mL的3mmol/L邻苯三酚溶液（溶剂为10mmol/L HCl，提前预热至25℃），混匀后于325nm下每隔30s测一次吸光值，反应4.5min结束。空白组为10mmol/L的HCl。一定线性范围内，计算每分钟吸光度的增加值。

样品自氧化速率的测定：取不同浓度的多糖溶液1.0mL，并按上述操作进行，其中蒸馏水添加量为3.2mL，平行测定3次后取平均值。超氧阴离子自由基清除率（I2）用公式（2）计算。同时，以抗坏血酸为对照，比较两种方法提取的金针菇多糖的清除能力。

式中：A1为邻苯三酚自氧化速率；A2为加多糖液后邻苯三酚的自氧化速率。

1.2.5 金针菇多糖对羟自由基（·OH）的清除能力 采用翟继英的方法，取不同浓度的多糖溶液1.0mL，加入9mmol/L FeSO₄和9mmol/L水杨酸一乙醇溶液各1.0mL，混匀后加入1.0 mL8.8mmol/L H₂O₂启动反应，37℃水浴30min，于510nm处测定吸光值（蒸馏水调零）。蒸馏水代替水杨酸为空白对照，蒸馏水代替多糖溶液为对照组，平行测定3次后取平均值。羟自由基清除率（I₃）用公式（3）计算。同时以抗坏血酸为对照，比较两种方法提取的金针菇多糖的·OH清除能力。

式中：Ao代表不加多糖溶液的空白对照液的吸光度；Ai代表加入多糖溶液后的吸光度；Aio代表无显色剂时多糖的自身吸收值。

2 结果与分析

2.1 热水与超声波提取金针菇多糖相对还原力比较

还原能力的测定可以衡量样品是否为一良好的电子供体，还原能力大的样品是良好的电子供体。待测物所供应的电子可以使Fe³⁺还原为Fe²⁺，使体系溶液颜色改变，即可反映出体系中氧化还原状态的改变。具有还原能力的金针菇多糖物质和Vc供应的电子使Fe³⁺还原为Fe²⁺，并最终生成普鲁士蓝，从而使体系吸光值显著上升。

如图1所示，在0.125～2.000mg/mL浓度范围内，随着浓度的增大，还原力都逐渐增强，当热水和超声提取多糖浓度增加8倍时，还原力分别增加了3.9和3.0倍，但二者差别并不大。以Vc作为对照，当浓度为0.125mg/mL时，其吸光值为0.57，而超声多糖吸光值为0.089，热水多糖吸光值0.077，Vc的还原力约为两种金针菇多糖还原力的6.4和7.4倍，在0.125～2.000mg/mL浓度范围内，Vc的还原力约为金针菇多糖还原力的4.8～8.1倍。

2.2 热水与超声波提取金针菇多糖对DPPH.清除能力

DPPH.是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物具有羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基，有打断脂质过氧化链反应的作用。热水与超声法提取金针菇多糖对DPPH.清除能力如图2所示，在0.125～2.000mg/mL浓度范围内，随浓度的增加，多糖对DPPH·清除能力逐渐增强，且两种多糖上升幅度基本一致，二者对DPPH·清除能力略有影响，但差别不大，当浓度小于1.5mg/mL，两种多糖对DPPH·清除能力小于Vc，当大于1.5mg/mL浓度时，与VC能力相当。

2.3 热水与超声波提取金针菇多糖对清除能力

超氧阴离子自由基是生物体内所有活性氧自由基中的第一个自由基，自身不太活泼，但可通过歧化反应和其它反应途径产生H，0，和羟自由基（·OH），是生物体中自由基产生的根源，所以清除超氧阴离子自由基意义很大。热水与超声法提取金针菇多糖对的清除能力如图3，在0.125-2.000mg/mL浓度范围内，对的清除能力随多糖浓度的增加而增加，两种多糖清除超氧阴离子的能力很接近，VC对超氧阴离子清除能力也逐渐增强，但清除能力略低于两种多糖。

2.4 热水与超声波提取金针菇多糖对·OH清除能力

本试验采用的是Fenton反应体系，以H₂O₂为氧化剂，以Fe²⁺为催化体系的氧化法。热水与超声法提取金针菇多糖对.OH清除能力如图4，在0.125～2.000mg/mL浓度范围内，对·OH的清除能力随着浓度的增加而增加，且两种多糖对羟自由基清除能力几乎相等，但不及Vc对·OH的清除能力，Vc对·OH的清除能力约为金针菇多糖清除能力的1.3～3.3倍。

3 结论

多糖是食用菌中最重要的活性成分之一，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化等抗氧化活性，从而起到保护生物膜和延缓衰老的作用，因此食用菌多糖成为保健食品、药品以及抗氧化剂开发的重要来源。食用菌多糖的抗氧化能力不仅与食用菌种类有关，也与提取纯度、提取部位等有关。如董丹丹对黑木耳、香菇、金针菇、双孢蘑菇多糖对.OH、DPPH.等的清除能力进行研究后发现，其多糖抗氧化能力依次为双孢菇>香菇>黑木耳>金针菇。

本试验结果表明，热水法与超声法提取的金针菇多糖抗氧化能力基本一致，且在0.125～2.000mg/mL范围内，随浓度增加，金针菇多糖的抗氧化能力增强；金针菇多糖对超氧阴离子的清除能力较强，对DPPH自由基的清除能力次之，对羟自由基的清除能力和相对还原力较低。本研究结果与王晶等利用超声波提取桑树皮黄酮的抗氧化能力结果一致，即超声波提取与热回流提取物质的体外抗氧化作用相当。但超声波提取对金针菇多糖分子链结构的影响如何，还有待进一步研究。