花生突变体的诱导与筛选利用

侯蕾 付春 夏晗 赵术珍 鲁成凯 赵传志 姜言生 王兴军

摘要：利用诱变创新种质材料是作物遗传改良和功能基因组学研究的重要途径。本研究以丰花l号、山花13号、潍花10号等10个主要推广的栽培花生品种为材料，利用EMS、印60Coγ射线、快中子辐射三种方法对成熟种子进行诱变处理，获得了一个含有30000多个M1代单株的诱变群体。对M2代突变体进行田间观察和近红外分析，初步筛选得到多份在叶、株型、荚果、种子发育等方面发生明显变异的材料。将具有明显性状变异的M2代突变体进行种植繁育获得M3代，进一步鉴定其表型变异的稳定性。这些材料的获得为花生遗传改良和功能基因鉴定提供了丰富的试验材料。

关键词：花生；突变体；EMS；60Coγ射线；快中子辐照；种质资源

中图分类号：S565.203.52

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）01-0011-05

花生是重要的油料和经济作物，培育高产优质高抗花生新品种对提高花生产值、增加农民收益有着重要意义。我国花生栽培种的遗传基础异常狭窄，当前推广的花生品种大多含有伏花生和狮头企的血缘，这在很大程度上限制了利用现有花生种质进行遗传改良的效果。通过射线、EMS等手段诱发基因发生变异，根据育种目标对这些变异进行筛选和鉴定，并在此基础上培育出新的种质材料和品种，拓展花生遗传背景，是改变这种现状的有效途径。近年来，直接利用突变体选育新品种或将突变体作为亲本材料进行杂交获得的新品种数量逐年增加，在花生、籼稻、小麦、大豆等多种农作物中均有应用。物理和化学方法诱发突变具有操作简单、变异率高等特点，突变性状通常稳定较快，可缩短育种周期。

突变体是克隆鉴定基因、研究基因功能最直接有效的材料，突变体的获得及分析在高等植物基础理论研究中发挥重要作用。例如拟南芥det2、dwfl和bril突变体表现出植株矮小、叶色暗绿、叶片上卷、发育延迟等性状，通过对这些突变体的研究阐明了油菜素内酯（BR）合成途径中关键酶和BR受体的功能，揭示了BR合成与信号传导通路在植物正常生长发育过程中的重要性。通过筛选分析番茄抗病性突变体，阐明了NRCl（NB-LRR protein required for HR-asso-ciated cell death l）蛋白在番茄叶霉菌抗性方面的重要作用。

辐射诱变是创制花生突变体的重要手段，主要诱变因子有60Coγ射线、离子束、激光等，快中子、32p照射等在花生诱变研究上也有所应用。60Coγ射线辐射是最常用的诱变方法，花育32号和花育22号均是采用60Coγ射线诱变处理育种材料，然后与优质高产的品系杂交，经系谱法选育而成。EMS作为诱变剂在花生诱变育种研究中也有报道。王传堂等将EMS注入花育16号和鲁花11号的花器进行诱变，成功获得了单株结果数、单株仁重、饱果率比对照有明显提高的突变体。多项研究证明快中子辐照在花生品质改良中具有一定的潜力，可以作为花生育种的一种辅助手段。

本研究利用EMS、60Coγ射线、快中子辐射三种方法获得了一个较大的花生突变体群体，初步筛选到多份在植株生长发育方面发生明显变异的材料，获得含油量、蛋白含量、油亚比发生明显变化的优良突变材料。这些材料的获得不仅为花生遗传改良提供了新的种质资源，也为花生功能基因的克隆鉴定提供了重要材料，对利用生物技术手段改良花生具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用生产上广泛种植的花生良种丰花1号、山花13号、花育22号、花育23号、花育36号、潍花10号、潍花12号、潍花16号、鲁花1 1号、开农1715共10个花生品种用于突变体的创制，材料由山东省农业科学院生物技术研究中心保存。对照与处理后的花生种子种植在山东省农业科学院生物技术研究中心饮马泉试验基地和济阳、东营、日照花生种植基地。

1.2 试验方法

1.2.1 诱变方法根据前人研究结果设定EMS处理溶液的浓度、60Coγ射线和快中子辐照的剂量。

60Coγ射线辐射处理：设置60Coγ射线300、500、1000Gy三种剂量辐照花生干种子，以不辐射处理作对照。辐射处理在山东省农业科学院农产品研究所进行。

快中子辐射处理：选择颗粒饱满的种子，辐照能量为14.OMeV，辐照剂量为14.0Gy，以不辐照种子为对照。辐照处理在中国原子能科学研究院进行。

EMS诱变处理：纯水浸泡种子约10h，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制0.2%的EMS诱变液，将泡好的种子倒人诱变液中，黑暗浸泡8h，每隔30min摇动一次。诱变液处理完后用水冲洗种子5次，每次20min。将诱变液和冲洗的废水与等体积0.5mol/L硫代硫酸钠溶液混合以去除毒性，倒掉废液。保持种子湿润透气，及时播种。对照用纯水浸泡。

1.2.2 突变体性状观察与鉴定在花生出苗期、营养生长期、开花期和收获期对M2代株系的株高、叶色、叶形、开花情况、分枝数量、果针发育等性状进行考察，收获后对荚果大小、果仁大小、荚果产量、出仁率等性状进行调查分析。

1.2.3 突变体种子不同成分检测 种子蛋白质、脂肪酸等不同成分检测采用近红外光谱分析法，仪器型号为DA 7250（Perten，Sweden）。以未诱变亲本为对照进行比较。

2 结果与分析

2.1 花生突变体创制过程

2013年，利用60Coγ射线300、500Gy两个剂量辐照花育22号、花育23号、花育36号、潍花12号、潍花16号、鲁花11号6个花生品种，种植后对M1代进行单株收获，得到含有8000余单株的M1代突变群体。同年利用0.2%的EMS溶液诱变处理丰花1号种子，收获M1代突变体单株2000多株。

2014年，利用浓度为0.2%的EMS溶液诱变处理山花13号和潍花10号，收获M1代单株3350株。同年，利用60Coγ射线500、1000 Gy两个剂量辐照山花13号，共收获M1代单株约10000株。另外，利用14.0Gy剂量的快中子诱变山花13号、潍花10号和开农1715，获得M1代单株约4800株。

在2014年和2015年分别将约10000份M1代种子播种，对M2代群体表型进行调查记录，将具有明显性状变异的M2代突变体进行种植繁育获得M3代，将其中的143份M3代突变体种子播种以进行表型验证，其余种子放人冷库保存。

2.2 叶片形态突变体的筛选

诱变处理对部分M，代突变体的叶色、叶形和叶片大小等产生了显著影响。筛选到的突变体有的叶片颜色较深、叶柄变短、叶片较小（图la）；有的叶片发生不同程度的卷曲、皱缩（图lb、d）；有的叶片黄化（图lc）；有的叶型明显细窄，叶片小、颜色发黄（图le）；有的植株异常矮小，叶片细小（图lf）。

2.3 植株形态突变体的筛选

在植株高度、分枝数、匍匐形态等方面发生变异的突变体很多。有的突变体株高明显高于亲本（图2a），突变体H22-30高度大约为67cm，而对照亲本花育22大约为40cm；有的植株表现矮化（图2b），突变体H36-10高度仅为15cm，明显低于对照亲本；有的突变体分枝数目增多，果荚数目也有所变化（图2c、d）；有的植株形态从直立型变成了匍匐型（图2e）。

2.4 荚果与种子相关突变体的筛选

诱变处理也产生了大量荚果和种子发生变异的突变体，例如有的突变体果型发生变化，腰型变粗，大多果荚只有一粒种仁（图3a）；有些种子大小发生变化（图3b、c），突变体4H23-15种子质量约是其对照亲本的0.69倍，而2W12-20大约是其对照亲本的1.28倍；有的种子种皮部分发紫或产生紫色斑点（图3d、e），或种皮开裂（图3f）。

2.5 种子成分突变体的筛选

利用近红外分析仪对花生突变体M2代单株种子中蛋白质、油酸、亚油酸含量和含油量进行测定，初步筛选得到蛋白、油酸、亚油酸等储藏物质含量与未诱变亲本相比有明显差异的突变体100多份，其中突变体LH11-502的含油量最高，达61.57%；HY36-528的蛋白质含量最高，为36.17%；WH12-2059的油酸含量最高，油亚比达到61.37（表1）。

3 结论与讨论

花生富含植物油脂和蛋白质，营养丰富，易被人体消化吸收。姜慧芳等检测了国内外4000多份花生种质材料，结果表明这些材料的平均含油量为50.57%，最高含油量为60.21%，90%以上花生品种的含油量在46%～56%之间。本研究筛选到多份含油量在58%以上的突变体材料，其中LH11-502的含油量远超过现有的种质材料，这些突变体的获得对于花生遗传改良提高含油量具有重要意义。

目前大面积种植的花生品种一般用作榨油，蛋白质含量偏低（26%左右），而鲜食花生品种考核指标要求蛋白质含量在30%以上。本研究筛选到多个蛋白质含量在31%以上的突变体，是培育鲜食花生的重要候选材料。

油酸是影响花生油理化稳定性和营养价值的重要品质指标。近年来，我国开始注重高油酸花生育种，并已经育成一些高油酸花生新品种，如开农61、花育32号、花育51号、开农H03-3、冀花11号等。但我国目前高油酸花生品种类型仍不够丰富，多为小果型，种植面积很小，且其亲本来源较局限，依赖于早期鉴定的极少数高油酸花生突变体。本研究获得的高油酸突变体中有7份材料的油亚比超过12：1，其中有些突变体还具有含油量高、产量高等特点。这些材料的获得拓宽了花生高油酸品种材料的范围，将有助于深刻阐明花生高油酸形成的分子机理，同时为今后培育新的高油酸品种及拓展其遗传多样性具有重要意义。

构建饱和的基因突变群体是分析鉴定基因功能最有效的方法之一，本研究筛选到的植株发育相关、种子品质相关的突变体，为花生功能基因组学的研究打下了良好的基础。本课题组还为花生突变体建立了信息档案，对每个突变体的表型、理化分析数据以及遗传分离比等信息做了详细的记录。突变体信息数据库的建立将促进花生突变体在不同研究团队间的材料交换与信息交流。