甜樱桃砧木吉塞拉离体茎尖玻璃化法超低温保存研究

朱东姿 宗晓娟 陈新 王甲威 徐丽 魏海蓉 谭钺 刘庆忠

摘要：为保持甜樱桃矮化砧木吉塞拉的遗传稳定性和避免种质遗传资源丢失，以玻璃化法超低温冷冻保存过程中涉及的主要因子设计正交试验，摸索适合吉塞拉的最佳保存体系；设计单因子试验，观察不同单因子对吉塞拉超低温冷冻保存的影响。结果表明，取生长90 d的组培苗于4 ℃低温锻炼3周或4周，剥取茎尖放于含0.3 mol/L蔗糖的预培养液中预培养1 d，在装载液中渗透30 min，用PVS3玻璃化试剂0 ℃处理60 min后投入到液氮中保存24 h，取出后经40 ℃水浴快速化冻1 min，卸载液洗涤两次，每次10 min，后置于恢复培养基上，茎尖的存活率最高且遗传稳定性好。本试验成功建立了甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化法超低温保存技术，为甜樱桃种质资源的长期保存提供了一条有效途径。

关键词：甜樱桃；矮化砧木；吉塞拉；茎尖；超低温冷冻保存；玻璃化法

中图分类号：S662.509+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）10-0134-07

我国具有丰富的樱桃种质资源，包括本土的中国樱桃和引进的甜樱桃品种及砧木资源，这些是进行抗性育种的基因库及进行种质改良的基础[1]。然而建立一个樱桃种质资源圃需要投入大量的人力、物力和土地[2]。因此，投入少、占地少且长期稳定的种质资源超低温冷冻保存方法逐渐被公认[3-5]，尤其是对果树等木本植物的保存。大多数果树由于其遗传与繁殖特点不能用种子进行保存，而以活体资源圃的方式保存又存在诸多问题，如成本高、效率低，且种质资源在保存过程中易发生变异等[6，7]。迄今已有10多种果树茎尖的超低温保存获得了成功，如苹果、杏、柑橘、桃、柿子等[8-12]。与苹果、杏等果树的超低温保存研究相比，樱桃超低温保存的研究较少，赵艳华等[13]用玻璃化法成功保存了马哈利樱桃的离体茎尖；Niino等[14]用玻璃化一步法成功保存了日本山樱、大岛樱及大紫甜樱桃等的离体茎尖。吉塞拉（Gisela）砧木是德国吉森大学以酸樱桃（Prunus cerasus L.）和灰毛叶樱桃（P. canescens L.）为亲本种间杂交得到的三倍体杂种矮化砧木[15]。吉塞拉树体开张，分枝基角大，在欧洲、北美应用广泛[16，17]。吉塞拉引进我国后与大多数甜樱桃品种亲合性良好，具有明显的矮化、丰产、早实性强、抗病、抗寒、土壤适应范围广等优良特性[18-20]。吉塞拉的引进及推广利用有利于克服我国甜樱桃生产的树体高大、难于管理等问题。然而随着现代甜樱桃生产的发展，矮化砧木品种在大范围内推广，原始品种和地方育种优系被陆续淘汰，这一方面改良了砧木，另一方面也造成了甜樱桃砧木种质资源的贫乏。

因此笔者尝试以甜樱桃矮化砧木吉塞拉为材料来研究樱桃的超低温冷冻保存技术，通过改进玻璃化法超低温保存条件，在保证吉塞拉种质资源遗传稳定性的基础上，进一步优化试验条件，提高冷冻保存的效率及稳定性。

1材料与方法

1.1试验材料

以甜樱桃矮化砧木吉塞拉5和吉塞拉6的离体茎尖为材料，组培苗在继代培养基MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+0.5 mol/L 蔗糖+0.7%琼脂（pH 5.8）上生长90 d，培养温度（25±2） ℃，光照强度75 μmo1/（m2·s），光周期16 h/d。

1.2试剂

预培养液（蔗糖梯度）：MS+0～1.2 mol/L蔗糖；装载液：MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖；PVS2：MS+30%（W/V）甘油+15%（W/V）乙二醇+15%（W/V）二甲基亚砜+0.4 mol/L蔗糖；PVS3：50% （W/V）甘油+50% （W/V）蔗糖；卸载液：MS+1.2 mol/L蔗糖。恢复培养基：MS+0.5 mg/L BA+0.5 mol/L 蔗糖+0.7%琼脂（pH=5.8）。Tiangen PCR mix；天根公司的快捷型植物基因组提取试剂盒（非离心柱型）；SSR引物由上海生工合成；PAGE凝胶所用药品均购买于上海生工。

1.3正交设计

根据L9（34）设计正交试验，以吉塞拉5为材料，选择低温锻炼时间、预培养液蔗糖浓度、预培养时间三因素，每因素设计三水平，共9组试验，每组重复3次，取平均值。利用SPSS 11.5软件和Microsoft Excel进行数据分析和作图。

1.4吉塞拉茎尖玻璃化法超低温保存步骤

取继代生长90 d的组培苗于4 ℃光照培养箱中低温锻炼0～10周。取带顶芽的茎段，在显微镜下剥取长度约1.5 mm的茎尖（不大于2 mm，一般含1～2个叶原基），放入预培养液中1～5 d，每组茎尖不低于30个；茎尖经过预培养后，放入装载液中，室温静置30 min；去除装载液，加入玻璃化溶液PVS2或PVS3，在0 ℃条件下放置30～90 min；吸掉玻璃化溶液，重新加入适量玻璃化溶液至恰好浸没茎尖，将冻存管放入液氮中冷冻5 min，再转移到大液氮罐中保存。从液氮罐中将冷冻24 h的冻存管取出，迅速放入40 ℃温水中快速化冻1 min，加入卸载液，洗涤两次，每次10 min，将茎尖转移到恢复培养基中，暗培养1周后转到光照培养室内培养，培养温度（25±2） ℃，光周期12 h/d，光照强度75 μmo1/（m2·s）。

光培养恢复2周后统计存活率，茎尖保持绿色或黄绿色、长出小叶或者脱分化形成愈伤组织的茎尖均视为存活。存活率（%）=存活的茎尖个数/总茎尖数×100，取3次重复的平均值。

1.5吉塞拉茎尖超低温保存后再生苗生长情况调查

选取长势一致、生长健壮的冷冻前后的吉塞拉5和吉塞拉6扩繁材料，接入继代培养基，每品种接6瓶，每瓶接4个芽，同品种放置在同一架面培养，培养温度（25±2） ℃，光照强度75 μmo1/（m2·s），光周期16 h/d。40 d后，取出材料调查再生苗生长情况。

1.6吉塞拉茎尖超低温保存后遗传稳定性的分子检测

1.6.1组培苗材料基因组DNA的提取使用天根公司的快捷型植物基因组DNA提取系统（非离心柱型）试剂盒提取组培苗叶片的全基因组，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.6.2SSR分子标记分析利用17对已发表的樱桃常用SSR引物进行PCR扩增[21-23]，进行引物初筛。PCR反应体系：模板2 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，50～60 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；72 ℃加尾5 min；4 ℃保存。

1.6.3聚丙烯酰胺凝胶电泳配制6%聚丙烯酰胺凝胶，恒定功率100 W，电泳2 h。电泳结束后，将凝胶分离出来，清洗两次，加入银染液轻轻摇动20 min，水洗两次；立即放入显影液中至DNA条带显出，用蒸馏水冲洗，室温下自然干燥，拍照。

2结果与分析

2.1正交试验

对正交试验结果（表1）进行分析，除预培养时间外，其余两个因子的结果都存在显著差异，最显著的是低温锻炼时间，F值达到60.61，远高于F0.05，但没有达到极显著差异水平；其次是预培养液蔗糖浓度，F值达到46.14。由正交试验结果得出，吉塞拉超低温冷冻保存过程中低温锻炼时间、预培养液蔗糖浓度、预培养时间三个因素的最佳水平分别是4周、0.3 mol/L和1 d。

2.2单因子对吉塞拉玻璃化法超低温保存的影响

正交试验虽能得到最优组合，但单因素具体如何影响超低温保存仍需进一步试验，笔者对低温锻炼时间、预培养液蔗糖浓度、预培养时间和玻璃化溶液及处理时间四个单因素分别进行研究。由图1 A可知，随着低温锻炼时间的延长，吉塞拉5

和吉塞拉6茎尖存活率均呈逐渐上升趋势。没有经过低温锻炼的吉塞拉5和吉塞拉6茎尖存活率分别是45.3%和47.5%，处理1周后的存活率分别是63.6%和68.7%，差异分别达到显著和极显著水平。吉塞拉5低温处理3周以内处理间的差异均达显著水平，即存活率升高趋势较快；低温处理4周以后处理间的差异不显著，即低温处理4周以后茎尖存活率升高趋势变缓。吉塞拉6低温处理2周以内处理间的差异显著，处理3周以后处理间差异不显著。但是随着低温锻炼时间的延长，培养瓶内营养、水分减少，组培苗开始萎蔫、发黄甚至死亡，不利于茎尖的剥取，因此吉塞拉5的低温锻炼时间应选取在4周，吉塞拉6应选取在3周。

由图1 B可知，吉塞拉茎尖玻璃化法超低温保存后的存活率随预培养时间的延长呈先升高后降低趋势，预培养1 d与没有经过预培养的差异显著，但预培养不同天数间的差异不明显，预培养1 d时茎尖存活率最高。

由图1 C可知，吉塞拉茎尖玻璃化法超低温保存后的存活率对预培养液中蔗糖浓度的变化较敏感。吉塞拉5和吉塞拉6茎尖存活率随着预培养液中蔗糖浓度的上升均呈现先上升再下降的趋势，过高的蔗糖浓度可导致存活率的降低，其中以含有0.3 mol/L蔗糖的预培养液效果较好，与其他蔗糖浓度预处理后获得的存活率呈现显著或极显著差异，存活率达90%以上。

由图1 D可知，PVS3处理吉塞拉茎尖的存活率明显较PVS2处理高。另外，处理时间的长短对于存活率的影响不管是在PVS2中还是在PVS3中都有显著差异，处理60 min时存活率最高。

结合正交试验和单因子试验结果，吉塞拉超低温冷冻保存的最佳体系是，剥取低温锻炼4周的组培苗茎尖，置于含有0.3 mol/L蔗糖的预培养液中预培养1 d，常温装载30 min，0℃、PVS3玻璃化溶液处理60 min，在该处理条件下，吉塞拉茎尖的存活率较高。

2.3吉塞拉超低温冷冻保存后遗传稳定性检测

从组培苗扩繁系数、生根能力、叶片长宽比、叶片颜色等性状对保存后的10株吉塞拉5、10株吉塞拉6共20株植株进行遗传稳定性鉴定，结果如表2，与未经超低温冷冻保存的G6组培苗相比，叶片长宽比叶片颜色扩繁系数生根条数未经超低温冷冻的G6组培苗1.35∶1深绿色12.5±2.19.7±2.4G5保存后1.39∶1深绿色13.4±1.89.2±2.9

G6保存后1.32∶1深绿色12.9±2.410.1±2.9其叶片长宽比、叶片颜色、扩繁系数、生根能力均无明显区别。以吉塞拉5为例，甜樱桃矮化砧木超低温冷冻保存茎尖再生苗过程如图2所示。

茎尖经过玻璃化法超低温保存后，再生培养45 d（图2 D），取不同批次的21株再生苗的叶片，提取基因组DNA，以未经超低温保存处理的组培苗叶片基因组为对照，共22份样品，采用SSR分子标记进行遗传稳定性检测。利用优化的PCR扩增体系筛选17对引物，根据扩增结果选取3对多态性较高、带型较清楚、分辨率较高的引物，分别为BPPCT026、BPPCT030、UCD-CH12（表3）。用这3对引物进行后续SSR分析，PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。

由图3、4可以看出，超低温保存后的样品与保存前的样品没有出现差异性条带，说明超低温保存后再生的植株与未经超低温保存的材料之间没有发生遗传变异。因此，基本可以确定超低温保存不会改变吉塞拉材料的遗传稳定性。

3讨论

为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，必须对材料进行预处理。预处理总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强植物的抗冻力，在预培养基中补充山梨醇、蔗糖等渗透剂，对提高细胞的耐冻力有明显的作用[24]。一般常见的预处理有低温锻炼、反复继代、预培养三种方法。我们的研究发现对于吉塞拉的预处理，以低温锻炼最佳，随着低温锻炼时间的延长呈上升趋势，这与在新疆野苹果中的发现不同，新疆野苹果超低温冷冻保存的成活率随着低温锻炼时间的延长，成活率呈下降趋势[12]，这可能与树种有关。但是随着低温锻炼时间的延长，培养瓶内营养、水分减少，组培苗开始萎蔫、发黄甚至死亡，不利于茎尖的剥取。结合蔗糖预培养处理，可以将低温锻炼的时间缩短到3～4周，大大缩减了试验周期。此外，吉塞拉茎尖超低温保存成活率随预培养液蔗糖浓度的增加先增后减，这与香蕉、苹果茎尖进行超低温保存时的趋势一致[12，25]。吉塞拉在预培养液蔗糖浓度为0.3 mol/L 时保存效果最好；香蕉、苹果在0.4 mol/L 时保存效果最好，且苹果需要预培养3 d，这与吉塞拉不同。预培养时间对吉塞拉茎尖成活率的影响不显著，但对苹果茎尖成活率却有很大影响。

本研究还对吉塞拉超低温保存后的遗传稳定性进行了检验，与未冷冻保存材料相比，再生苗扩繁系数、生根能力、叶片长宽比、叶片颜色等方面均无明显差异。利用SSR分子标记从分子水平进行检测，结果显示超低温保存后再生的植株没有发生遗传变异。

4结论

综上所述，甜樱桃矮化砧木吉塞拉玻璃化法超低温保存的最优条件是，取生长90 d的组培苗于4℃低温锻炼3周或4周（吉塞拉5，4周；吉塞拉6，3周），剥取茎尖放于预培养液中（MS+0.3 mol/L蔗糖）预培养1 d，在装载液中渗透30 min，用PVS3玻璃化试剂0 ℃处理60 min后投入到液氮中保存24 h，取出后经40 ℃水浴快速化冻1 min，经卸载液洗涤两次，每次10 min，后置于恢复培养基上，茎尖的存活率最高且遗传稳定性好。

参考文献：

[1]黄晓姣，王小蓉，陈涛，等. 中国樱桃遗传资源多样性研究进展[J]. 果树学报，2013，30（3）：470-479.

[2]任国慧，俞明亮，冷翔鹏，等. 我国国家果树种质资源研究现状及展望——基于中美两国国家果树种质资源圃的比较[J]. 中国南方果树，2013，42（1）：114-118.

[3]陈晓玲，张金梅，辛霞，等. 植物种质资源超低温保存现状及其研究进展[J]. 植物遗传资源学报，2013，14 （3）：414-427.

[4]Sakai A， Engelmann F. Vitrification， encapsulation-vitrification and droplet-vitrification： a review[J]. CryoLetters，2007，28（3）：151-172.

[5]Kami D. Cryopreservation of plant genetic resources [M]//Current Frontiers in Cryobiology.2012.

[6]苗红霞，宋尚伟，王娟. 果树种质资源超低温保存技术研究进展[J]. 中国农学通报，2007，23（9）：392-398.

[7]柳金伟，陈新，徐丽，等. 果树种质资源超低温保存研究进展[J]. 山东农业科学，2013，45（3）：122-125.

[8]艾鹏飞，罗正荣. 柿和君迁子试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性研究[J]. 中国农业科学，2004，37（12）：2023-2027.

[9]王子成. 柑橘种质资源的离体保存研究[D]. 武汉：华中农业大学，2002.

[10]赵艳华，吴雅琴. 桃离体茎尖的超低温保存及植株再生[J]. 园艺学报，2006，33（5）：1042-1044.

[11]Channuntapipat C， Collins G， Bertozzi T， et al. Cryopreservation of in vitro almond shoot tips by vitrification[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology，2000，75（2）：228-232.

[12]吴传金，陈学森，曾继吾，等. 新疆野苹果（Malus sieversii）超低温保存及其植株再生[J]. 植物遗传资源学报，2008，9（2）：243-247.

[13]赵艳华，吴永杰，周明德. 马哈利樱桃离体茎尖超低温保存的研究[J]. 园艺学报，1999，26（6）：402-403.

[14]Niino T，Tashiro K，Suzuki M，et al. Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of cherry and sweet cherry by one-step vitrification[J]. Scientia Horticulturae，1997，70：155-163.

[15]Franken-Bembenek S. Gisela 5 （148/2） - dwarfing rootstock for sweet cherries[J]. Acta Horticulturae，1998，468： 279-284.

[16]Milatovic' D，Durovic' D，Dorevic' B，et al. Testing of sweet cherry cultivars on ‘Gisela 5 rootstock[J]. Acta Horticulturae， 2013，981（1）：167-171.

[17]Neilsen G H，Neilsen D，Kappel F，et al. Factors affecting establishment of sweet cherry on Gisela 6 rootstock[J]. HortScience，2010，45（6）：939-945.

[18]李勃，刘成连，杨瑞红，等. 樱桃砧木抗寒性鉴定[J]. 果树学报，2006，23（2）：196-199.

[19]刘庆忠，张力思，李勃，等. 甜樱桃矮化砧木新品种‘吉塞拉5号[J]. 园艺学报，2005，32（4）：760-763.

[20]刘庆忠，张力思，李勃，等. 甜樱桃矮化砧木新品种‘吉塞拉6号[J]. 园艺学报，2006，33（1）：213-214.

[21]Dirlewanger E， Cosson P， Tavaud M， et al. Development of microsatellite markers in peach [Prunus persica （L.） Batsch] and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry （Prunus avium L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics，2002，105（1）：127-138.

[22]Testolin R， Marrazzo T， Cipriani G， et al. Microsatellite DNA in peach （Prunus persica L. Batsch） and its use in fingerprinting and testing the genetic origin of cultivars[J]. Genome，2000，43（3）：512-520.

[23]Struss D， Ahmad R， Southwick S M， et al. Analysis of sweet cherry （Prunus avium L.） cultivars using SSR and AFLP markers[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2003，128（6）：904-909.

[24]Sopalun K， Thammasiri K， Ishikawa K， et al. Vitrification-based cryopreservation of grammatophyllum speciosum protocorms[J]. CryoLetters，2010，31（4）：347- 357.

[25]吴黎明， 曾继吾， 彭抒昂， 等. 香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生[J]. 园艺学报， 2006，33（3）：501-506.