河南鸡公山小鱼仙草挥发油的抑菌作用及组分分析

陈利军 陈月华 周巍 尹健 胡孔峰 杨俊杰

摘要：【目的】明确河南鸡公山产小鱼仙草挥发油的抑菌活性，掌握其化学组分，为小鱼仙草的开发应用提供理论依据。【方法】通过水蒸气蒸馏法提取采自河南鸡公山的小鱼仙草挥发油，采用生长速率法测定挥发油对4种植物病原真菌（番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌和莴苣菌核病菌）的熏蒸抑制作用，并用气相色谱—质谱联用法（GC-MS）分析挥发油的化学组分。【结果】小鱼仙草挥发油对供试4种植物病原真菌菌丝生长均有强烈的熏蒸抑制作用，半最大效应浓度（EC50）均低于10.00 μL/皿；GC-MS法从小鱼仙草挥发油中共分离出22个组分，鉴定了20个组分，占挥发油总量的98.822%；挥发油的主要组分为桉树脑（64.684%）、β-蒎烯（7.963%）、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯（5.239%）和β-水芹烯（4.673%）等。【结论】河南鸡公山产小鱼仙草的挥发油对植物病原真菌有强烈的熏蒸抑制作用，可作为熏蒸剂应用于植物病害防控。

关键词： 小鱼仙草；挥发油；抑菌作用；GC-MS分析；鸡公山

中图分类号： S432.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1875-05

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical references for development and applocation of Mosla dianthera， the antifungal activity and chemical constituents of essential oil from M. dianthera in Jigong Mountain of Henan were investigated. 【Method】Essential oil was extracted from M. dianthera by steam distillation， and through fumigation， its inhibitory effects on four plant pathogenic fungi namely Botrytis cinerea， Fusarium graminearum， Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum were studied by determining growth rate. Meanwhile， chemical constituents of essential oil were analyzed by GC-MS. 【Result】Essential oil from M. dianthera showed strongly inhibitory effect on growth of four target plant pathogenic fungi， and its 50% effective concentration（EC50） was less than 10 μL/dish. Twenty-two chemical constituents were isolated from essential oil， and 20 of which were identified， accounting for 98.822% of total essential oil. The main chemical constituents of essential oil were eucalyptol（64.684%）， β-pinene（7.963%）， 1，3，6-octatriene，3，7-dimethyl-，（Z）-（5.239%）， and β-phellandrene（4.673%） etc. 【Conclusion】Through fumigation， essential oil from M. dianthera in Jigong Mountain of Henan shows strongly inhibitory effect on plant pathogenic fungi， which is used as a fumigant for controlling plant disease in the future.

Key words： Mosla dianthera； essential oil； antifungal activity； GC-MS analysis； Jigong Mountain

0 引言

【研究意義】植物挥发油又称精油，是从植物中分离提取的有特征香气的一类次生代谢物质，为具有挥发性的油状液体（徐汉虹，2001）。植物挥发油化学成分多样，同一植物不同产地、生育期、部位等挥发油组分存在明显差异（陈利军等，2014）。一些植物的挥发油具有抑菌活性，结合其易挥发的特性可作为仓储、设施农业、土壤等的熏蒸剂，防控病、虫、线虫等的为害（陈利军等，2014；陈飞等，2015），且具有高效、低毒、环保等特点，是理想的绿色生物熏蒸剂（王昌禄等，2014）。唇形科植物小鱼仙草[Mosla dianthera（Buch.Ham.）Maxim]又名疏花荠苧、野香薷、假荆芥等，在我国主要分布于长江流域及以南，全草入药，民间常用于治疗感冒发热、中暑头痛、皮炎、湿疹及灭蚊等（吴征镒和李锡文，1977）。小鱼仙草全株含丰富的挥发油，因此研究其挥发油的化学组分及抑菌活性，对有效开发利用小鱼仙草资源具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有一些对小鱼仙草挥发油化学组分分析的研究报道。兰瑞芳（2000）报道福建高盖山产小鱼仙草挥发油的主要化学组分为石竹烯、葎草烯、叩巴烯、香橙烯、洋芹子油脑、榄香脂素等。林文群和陈忠（2002）研究报道了福建省福清市和福州市两地的小鱼仙草挥发油化学组分，两地挥发油主要组分种类差异明显。毛红兵等（2012）报道浙江温州产小鱼仙草挥发油主要组分有异丁香烯、二环庚烯和环己烯。Wu等（2012）报道产自浙江浦江的小鱼仙草挥发油主要组分为榄香脂素、麝香草酚、β-石竹烯、异榄香脂素、细辛脑、α-石竹烯等，并测定了挥发油的抗流感病毒活性。【本研究切入点】鸡公山位于河南省最南端，为亚热带向暖温带的过度地段，地处我国南北的分水岭，物种丰富。小鱼仙草在鸡公山较常见，但目前尚未有关于其挥发油组分及抑菌活性的研究报道。【拟解决的关键问题】采用水蒸气蒸馏法提取采自河南鸡公山的小鱼仙草挥发油，以4种植物病原真菌为目标菌，测定小鱼仙草挥发油的熏蒸抑菌活性，并采用气相色谱—质谱联用法（GC-MS）分析挥发油的化学组分，以期为小鱼仙草的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试小鱼仙草全草于2015年7月下旬采自河南省信阳市鸡公山国家级自然保护区，带回室内后自然阴干。供试植物病原真菌菌株：番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）和莴苣菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）均由信阳农林学院植物病理实验室分离保存。培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水10000 mL）。主要仪器设备： Agilent 6850/5975气质联用仪，NIST05谱库。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 挥发油提取 阴干的小鱼仙草剪为短于0.5 cm的小段，然后采用水蒸气蒸馏法（陈利军等，2014）连续提取2 h，得到浅黄色具浓郁气味的油状液体，即为小鱼仙草挥发油。挥发油4 ℃冰箱保存备用。

1. 2. 2 挥发油熏蒸抑菌作用测定 将植物病原真菌置于PDA培养基上22 ℃下培养2～3 d后，用打孔器在菌落边缘打取若干直径5 mm的菌饼。熏蒸抑制作用测定采用陈利军等（2014）的生长速率法，挥发油剂量根据预试验设置。将皿底皿盖对扣后用Parafilm封口膜密封，22 ℃培养，48 h后观察水稻纹枯病菌和莴苣菌核病菌的生长情况，72 h后观察番茄灰霉病菌和小麦赤霉病菌的生长情况，并采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。对照仅放一张滤纸片不滴加挥发油。重复3次。

抑菌率（%）=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100

按照武怀恒等（2014）的方法在Excel 2007上拟合毒力回归方程。

1. 2. 3 挥发油GC-MS分析条件 色谱条件：色谱柱为HP-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升温，柱初温60 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升温速率升至90 ℃，再 以10 ℃/min升温速率升至180 ℃，载气为高纯氦气，流量1.0 mL/min，进样量1.0 μL。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围33～350 amu。

2 结果与分析

2. 1 小鱼仙草挥发油对植物病原真菌的熏蒸抑制作用

河南鸡公山产小鱼仙草挥发油对供试4种植物病原真菌菌丝生长的熏蒸作用及毒力测定结果见表1和表2，根据毒力回归方程计算半最大效应浓度（EC50）。结果表明，小鱼仙草挥发油对4种植物病原真菌均有强烈的熏蒸抑制作用，EC50均低于10.00 μL/皿，其中对水稻纹枯病菌的抑制活性最强，EC50仅为3.73 μL/皿。

2. 2 小鱼仙草挥发油组分GC-MS分析结果

GC-MS分析小鱼仙草挥发油化学组分的总离子流，结果见图1。利用色谱峰面积归一法测得各组分的相对含量，所得质谱图经NIST05质谱数据库检索，并与标准图谱核对，从小鱼仙草挥发油中共分离出22个组分（表3），鉴定出20个组分，占挥发油总量的98.822%。

从表3可看出，小鱼仙草挥发油的主要化学组分为桉树脑（64.684%）、β-蒎烯（7.963%）、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯（5.239%）、β-水芹烯（4.673%）等。

在鉴定的20种化合物中，以萜类化合物为主，其中倍半萜类化合物最多（10种），但相对含量少，仅占挥发油总量的7.602%；其次是单萜类化合物（9种），占挥发油总量的90.185%，是挥发油的主要化合物质种类；另有1种酮类化合物，占挥发油总量的1.035%。19种萜类化合物中有萜烯类17种，占挥发油总量的32.815%。

3 讨论

植物挥发油的化学成分一般分为4类：萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮含硫化合物（冯武， 2006；林立等，2015；吴恒等，2015）。在这些大量的化合物组分中，小分子的酚类物质、萜烯类物质和醛酮类物质是主要的抑菌有效成分（李亚茹等， 2014）。采自河南鸡公山的小鱼仙草挥发油主要化合物种类为萜类，在被鉴定的20种化合物中，萜类有19种，其中萜烯类17种，占挥发油总量的32.815%。小鱼仙草中相对含量最高的化合物为桉树脑，占64.684%，已有研究表明桉树脑具有显著的抑菌活性（孟雪等， 2010）。本研究中小鱼仙草挥发油对供试4种植物病原真菌表现出强烈的熏蒸抑制作用，EC50均低于10.00 μL/皿，证实小鱼仙草挥发油具有显著的抑菌活性，因此，利用小鱼仙草挥发油的显著抑菌活性有望研發出熏蒸剂应用于植物病害防控。有关小鱼仙草挥发油单体组分的熏蒸抑菌活性、组分间互作及主要成分桉树脑在抑菌活性中的具体作用有待进一步研究。

本研究中，河南鸡公山产小鱼仙草挥发油的主要化学组分为桉树脑及β-蒎烯、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、β-水芹烯等，与浙江（毛红兵等，2012；Wu et al.，2012）、福建（兰瑞芳，2000；林文群和陈忠，2002）等地产小鱼仙草挥发油的主要化学组分有所不同，可能是由于产地不同（林文群和陈忠， 2002），不同的生境对植物挥发油成分的生物合成过程造成影响所致。

4 结论

本研究采用GC-MS从河南鸡公山产小鱼仙草提取的挥发油中共分离出22个组分，鉴定了20个组分，主要组分为桉树脑、β-蒎烯、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、β-水芹烯等。小鱼仙草挥发油对植物病原真菌有强烈的熏蒸抑制作用，可作为熏蒸剂应用于植物病害防控。

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（责任编辑 麻小燕）