金属硫蛋白突变体的烟草植物高效表达载体探讨

刘晨

摘 要：金属硫蛋白通常由α和β两个结构域组成，其中α的结构域构成包括Cd2+和Hg2+，小鼠突变体则在大肠杆菌中进行搭建，并获得了转基因植株。为了更好地增强外源基因在烟草中的表达效果，可以在基因起始密码子ATG附近融入适合植物需要的碱基组合AACAATG，这种组合有利于将突变体基因插入具有35S强启动子的植物双元表达载体pGPTVd35S-BAR中，并获得αα突变体的植物双元表达载体。在本次研究中，将采用PCR-Southern和蛋白Dot-blotting检测方法，证明αα突变体可以在烟草中良好地表达。同时，在抗重金属的实验中证明转基因烟草能够在Cd400中良好的生长。

关键词：金属硫蛋白突变体 植物高效表达载体 烟草 转基因

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2016）4（c）-0000-00

现阶段，我国植物基因工程技术得到了全面的发展，外源基因通过不同的方法进入植物体中。尤其是使用转入外源基因的方式能够有效地提高植物吸附重金属的能力，有利于解决环境污染问题。在工农业文明持续发展的过程中，废水、废气、废渣及农药的不合理使用对环境资源造成了严重的损害，其中重金属污染主要以Cd2+、 Hg2+、Pb2+为主。它们在食物链的循环过程中将会影响人类的生命健康。除此之外，在自然界中金属硫蛋白（MT）发挥着至关重要的作用，这也是本文探讨的主要方向。

1 金属硫蛋白的基本概念

金属硫蛋白是一类低分子量富含半胱氨酸的金属结合蛋白，可以结合排除体内过量的重金属物质。与此同时，在植物界存在一类多肽物质，即植物络合态，它是一种酶促合成的产物，在重金属大量存在的时候会有全新的表达。除此之外，植物本身对重金属的抵抗能力是有限的，需要通过植物转基因技术将金属硫蛋白基因转入植物体内。

金属硫蛋白通常由α和β两个结构域组成，其中α的结构域构成包括Cd2+和Hg2+，在构建MT重组体αα的过程中，其中β结构域被α结构域所代替，通过实验我们认为αα的稳定性与天然MT相同。因此，当我们在考虑将αα转基因放入植物体内时，可以优化植物对重金属的承受力。在该方面的研究中，我们认为重金属的含量与植物体内的αα基因的蛋白量成正相关关系，并证实了转入αα基因的烟草对Cd2+有较好的抵抗性。

2 金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的实验探究

2.1 材料与方法

本次实验我们选取了含有小鼠MT重组体的αα基因cDNA质粒pBSαα、质粒pUC18、农杆菌LBA4404、helper质粒pRK2013，在酶和试剂的选择上包括EcoRⅠ、HindⅢ、XbaⅠ、SacⅠ、T4 DNA ligase等。

其探究方法包括以下几个步骤。首先，我们需要将PCR扩增αα基因，即以pBSαα为模板，得到PCR后加入突变位点的ααcDNA基因。随后需要搭建pUC18αα测序载体，并使用baⅠ/SacⅠ双酶切去磷酸化，保存，2%片段进行定向克隆到酶切过的pUC18中完成酶切鉴定。与此同时，搭建植物高效表达式载体，将准备好的35 S的质粒pBI426及植物表达载体pGPTV-BAR用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切，在去磷酸化之后完成酶切筛选。值得注意的是，在该载体搭建的过程中需要按照正确的测序顺序进行，并搭建与pGPTVd35S载体相同的酶XbaⅠ/SacⅠ酶切。除此之外，我们还要对含有αα转基因的植株和PCR进行PCR-Southern鉴定，即通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89获得抗除草剂植株，并提取烟草叶DNA，在分离纯化之后进行PCR扩增。最后，我们将完成对含有αα基因的转基因植株的蛋白Dot-blot鉴定。具体为：将叶片经液氮处理并研磨成粉末，并研制成浆液，取清液Bio-Rad点样器点样于NC膜上，取总蛋白量100μg上清点样于孔中，随后抽滤为真空状态，进行抗体抗血清反应。

2.2 结果

在 PCR产物的酶切及鉴定上，由于αα为两个重复的片段，所以出现了两条带。在PCR回收的片断XbaⅠ/SacⅠ双酶切后进行了蓝白斑的筛选，且酶切结果显示为阳性克隆。随后，完成35S启动子植物表达载体的构建，具体表达如图1所示。

图1 35S启动子植物表达载体的构建示意图

与此同时，在转基因植株的PCR、PCR-Southern鉴定上，我们提取了烟草叶的DNA并进行PCR扩展，以αα的两端为5和3引物，其反应体系可为25?I。引起该反应的基本条件为96℃ 5 min，94℃ 5 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min为一个循环，然后进入30个循环； 94℃ 1 min，60℃ 1min，72℃ 2 min，最后72℃延伸10 min。这是由于αα是重复的基因，在PCR时得到的两条带分别为119bp和215bp。当我们对该片段进行稀释后可使用1.5%琼脂糖胶分离转尼龙膜，完成杂交过程。

在转基因植株抗性实验上，每种浓度的试剂都有6-8棵植株样本，并进行为期30天的觀察。具体而言，需要将培养的生根植株移栽到不同浓度梯度的Cd2+培养容器中，经过30天的培养，Cd200的培养容器内转基因烟草的生长状态显示为正常；Cd300的转基因植株其内根系相对正常，但是比起Cd200的植株根系较为短粗；Cd400的转基因烟草的根系少数颜色为褐色，且叶片轻微发黄，总体生长正常。对照烟草植株的根系在Cd200时就无法正常生存。

2.3 讨论

使用PCR方法进行实验探究，并以pBS-αα为模板得到了起始密码子ATG前加上AACA四个碱基的突变体基因。通过装入测序载体验证了序列的正确性。因此，我们认为提高外源基因在植物体中的表达，建立高效的表达载体和较强的启动子具有重要的参考价值。即在pGPTVd35S表达载体构建的过程中，Gus npt基因的上游有两个串联的35S启动子和AMV序列，下游则是Nos终止子。除此之外，该载体还包含了Pnos启动子驱动的bar基因。综上所述，我们认为转基因烟草可以用除草剂来进行初步筛选。当我们利用XbaⅠ/SacⅠ切掉Gus npt基因后，插入测序正确的αα突变体基因时便得到了植物双元表达载体。根据双子叶植物的密码子，改变碱基，并将密码子的使用频率由原先的44%提升到56%，5引物中的原TGT改为TGC，3引物中原AGG改为现在的AGT，证明了启动子强弱对外源基因表达有直接影响，且处于关键位置。与此同时，植物对碱基的偏爱主要受到特定碱基组合的干扰，即可以提高mRNA的稳定性以及蛋白翻译的起始频率。此外，在优化高效表达的过程中，我们进行了以下三部分的调整，包括：转录水平调控35S-35S；转译水平的调控AMV基因的5-非转译序列；转译水平调控改变ATG附近位置的碱基组成。

3 结语

本文综合考虑了影响植物体的多种因素，优化各项条件和环境，从而搭建了αα突变体基因的植物高效表达载体，并成功获得了转基因植株。在初步检验的过程中有效地证明了外源基因已嵌合。对于已经生根的植株的移植方面，说明在Cd400的培养浓度下可以正常地生长，其它的抗性实验仍有很大的发展空间。

参考文献：

[1] 杨传平，玉成.柽柳、星星草金属硫蛋白基因双价植物表达载体的构建及其在烟草中的表达[J].东北林业大学学报.2013（5）.

[2] 张晓钰，左晓峰.小鼠金属硫蛋白突变体αα-cDNA在烟草中的表达及转基因烟草对Cd2+抗性的提高[J].中国生物化学与分子生物学报.2010（10）.

[3] 芮志佩.金属硫蛋白（MT）基因植物表达载体的构建及其在水生美人蕉中表达的初步研究[D].扬州大学.2009（5）.