动物源食品中氟喹诺酮类兽药残留检测的研究进展

张冬冬 苏超 洪伟 李莎 张廷廷

摘 要：抗生素滥用现象在动物源食品的生产加工中较为严重，因此抗生素残留检测是食品质量安全的重要内容。该文综述了动物源食品中氟喹诺酮类兽药残留检测的研究进展，梳理了各类检测技术并对技术的适用性进行了分析，对检测技术的发展方向提出了建议。

关键词：兽药；抗生素；氟喹诺酮；检测

中图分类号 TS207.5 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）13-0038-04

氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQs），又称吡啶酮酸类、沙星类，属于含氟第三代喹诺酮类化学合成抗生素。其抗菌作用机制是：抑制细菌DNA螺旋酶，阻碍DNA的正常复制、转录、转运与重组，对G-菌、G+菌均有抗菌活性，对衣原体、支原体也有一定抗菌作用。目前世界上已经有十几种FQs类药物上市（其中甲磺酸达氟沙星、盐酸二氟沙星、恩诺沙星、盐酸沙拉沙星是专门的兽用抗生素），并有数十种新型FQs类药物处于研发中[1]，在动物性食品的生产过程中，美国已经禁用氟喹诺酮类药物，日本、欧盟与我国虽未禁用，但规定了限用种类和最高残留限量[2]。虽然我国农业部先后发布了《兽药停药期规定》[3] 和《动物源性食品中兽药最高残留限量》等相关法规[4]，但是由于从业人员缺乏相应知识而造成药物的过量使用及不遵循休药期，甚至片面地追求经济利益，在饲料生产、动物养殖、食品加工等环节中滥用现象严重，其结果，一方面导致细菌耐药性产生，另一方面FQs药物残留可通过食物链进入人体，可损害内分泌系统、消化系统、皮肤系统、神经系统、生殖系统、泌尿系统[5]。由于我国对兽药滥用和危害的重视起步较晚，相关监管落实不严，需要通过检测技术的不断进步和完善，来构筑监测和防控抗生素滥用的健康防线。下面将氟喹诺酮类药物检测的相关技术进行梳理归纳。

1 我国现行的氟喹诺酮类兽药残留检测标准

查阅国标和农业部的现行相关标准，对我国现行的FQs残留检测标准分析如下：

（1）《GB/T 21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法：液相色谱-质谱/质谱法》[6]，要求使用固相萃取方法（SPE）进行前处理，并使用液质联用（HPLC/MS/MS）进行检测。该法检测结果灵敏度高、检测限低、可定性、定量，但仪器要求高、过程耗时、步骤繁琐、影响回收率因素多、检测成本昂贵等问题，在日常检测过程中很难加以应用，适合作为残留验证参考。

（2）《农业部1025号公告-14-2008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测—高效液相色谱法》提供的方法[7]，同样是使用SPE方法进行前处理，使用HPLC（配荧光检测器）进行检测。该法检测限低、灵敏度高，降低了仪器要求，但同样存在过程耗时、步骤繁琐、影响回收率因素多、需专用的一次性SPE柱，检测成本较高等问题。

（3）《农业部1025号公告-8-2008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测—酶联免疫吸附法》[8]采用常规萃取分离方法进行前处理，使用酶联免疫法（竞争性Elisa）进行检测。该法检测的特异性强、仪器要求低，但存在交叉反应，无法准确定量、检测限、定量限高、试剂盒（条）质量批次差异大、竞争性Elisa容易出现假阳性现象等问题。

2 国内外氟喹诺酮类兽药残留检测方法及进展

2.1 微生物法 微生物法操作方便、设备简单、检测成本低，但是对FQs药物检测的灵敏度低，并且具有选择性，用微生物法检出的阳性样品，还需其他检测方法进行确认。同时，微生物的生长繁殖耗时较长，检测效率不高，仅适合大规模样品的现场初筛使用。

微生物法对FQs药物残留进行检测第一步就是要筛选合适的敏感菌，目前各国药典所收录的抗生素菌种主要有藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等[9]。检测样品可以直接作用于敏感菌，或常规萃取方法获得样品提取液，再对其进行敏感菌生长抑制实验，具体的检测方法包括：杯碟法、FAST法、CAST法、STOP法、纸片法、亮黑还原试验法、delvotest法、TTC法等[10]。

Okerman等[11]报道了用改进欧洲四碟法检测零售肉中恩诺沙星和环丙沙星的残留，但检测限高于欧盟所规定的最高残留量（MRLs），只能检测高浓度 FQs残留，且不能准确定性。Maki等[12]采用对蜂蜜中的7种FQs进行残留分析，检测限（P/N>3）能达到2～9μg/kg；Nagel等[13]用3种抗生素高敏感型细菌（嗜热脂肪土芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌），以微滴板法（半定量）准确区分牛奶中包括氟喹诺酮类的4类抗生素残留，将传统培养皿法耗时24h缩短到6h；Kim等[14]运用纸片法测定了97头猪和83只鸡体内氟喹诺酮和四环素残留，其中猪肉阳性反应率为39%，鸡肉阳性反应率为13%；刑应寿等[15]以藤黄微球菌为敏感菌，用杯碟法测定环丙沙星在鸡肉组织中的残留，此法对环丙沙星在磷酸缓冲液、肌肉、肝脏和肾脏中的检测限分别为0.025、0.05、0.075μg/g；石颖[16]分离了青海弧菌Q67，以此为敏感菌检测猪肉浸提液，结果显示低浓度喹诺酮类兽药比磺胺类和呋喃类灵敏度高，最小检出限为0.002mg/L。

2.2 免疫分析法 免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法，其前处理简单、特异性强、灵敏度高、仪器要求条件低，但存在交叉反应、无法准确定量、容易出现假阳性现象等问题，且免疫试剂的质量差异大，使得该法不适合作残留确证，适用于快速筛选。

由于FQs药物分子量较小，不具备免疫原性，仅能以半抗原的形式与载体形成人工抗原，再以人工抗原免疫动物制备抗体，在体外检测中，研究应用较多的检测方法有酶联免疫法、免疫胶体金法、免疫荧光法、免疫亲和色谱、免疫传感器等[17]。

Duan等[18]制备了环丙沙星多克隆抗体，建立了环丙沙星兽药残留的竞争ELISA检测方法，检测了猪肉、鸡肉、牛乳中的环丙沙星残留，检测限为0.32ng/mL，加标回收率分别为75.58%、81.2%、84.50%，多克隆抗体与恩诺沙星和诺氟沙星的交叉反应率分别为69.8%和44.6%。邢广旭[19]在分析FQs类药物分子结构和免疫原性基础上，采用二环己碳二亚胺法将半抗原Nor（Nor结构是FQs类药物的母核结构）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）进行连接制备免疫抗原（Nor-BSA）和包被抗原（Nor-OVA），研制成功FQs药物的ELISA多残留检测试剂盒和FQs药物的mAb胶体金免疫试纸。结果表明，试剂盒的半抑制浓度（IC50）为4.61～6.27μg/L，试纸检测50份猪肉阴性样品的假阳性率为0，检测72份猪肉阳性样品假阴性率为0；不同批次的试纸批内变异系数和批间变异系数均小于10%。

2.3 理化检验法 FQs兽药残留检测的微生物法和免疫分析往往只是用于初检和快速检验，不能准确的定量，也不能用于定性的确证，在进行准确定量和定性确证的要求下，需要一些理化检验手段，如高效液相色谱（HPLC）、液质联用（LC/MS）、高效毛细管电泳（HPCE）、发光分析（CL）等。

2.3.1 色谱及联用技术 在FQs兽药残留检测中的色谱方法有薄层色谱法（TLC）、气质联用（GC-MS）、高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱（UPLC）及液质联用技术等，其中研究较多的为HPLC、UPLC和液质联用方法。HPLC、UPLC能够进行较为精确的定量，待测组分在色谱分离后可采用的检测器有紫外、荧光和质谱检测器等，由于FQs类药物化学结构具有荧光特性，所以较多采用荧光检测器。HPLC、UPLC具有很高的分离复杂样品基质的能力，但是不能获得物质的结构特征，主要依靠与标准品对照来判断目标物是否存在，不是确证手段。近年来，随着质谱技术的发展，液相色谱-质谱（LC/MS）、液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）逐渐成为动物源性食品中抗生素残留分析的研究热点，质谱则可提高物质的具体结构信息，其具有高度选择性以及强大的定性能力。

但色谱学方法的前处理过程较为复杂，目前兽药残留检测的前处理技术研究较多的有固相萃取（SPE）[20]、固相微萃取（SPME）[21]、基质固相分散（MSPD）[22]、分子印迹（MIT）[23]、磁性固相萃取（MSPE）[24]等前处理技术，这些前处理方法，存在成本高、回收率低等缺点；某些高端仪器如LC/MS/MS在日常检测中也难以普及。

长尾稔[25]等用HPLC（配荧光检测器）同时测定猪肉、牛肉及鸡肉中6种氟喹诺酮类药物残留的简化分析方法，回收率可达80%以上，检出限范围为0.002 5～0.05mg/kg。Moema等[26]检测鸡肝脏中的6种FQs兽药残留，样本经分散液-液微萃取净化，用HPLC（配二极管阵列紫外检测器）测定，在30～500μg/kg线性范围内相关系数R为0.994 5～0.997 4，相对标准偏差RSD为4%～7%，分别添加50、100、300μg/kg标准品回收率范围为83%～102%，检出限LOD为5～19μg/kg。孙雷[27]等建立了检测猪肉组织中7种氟喹诺酮类兽药残留的高效液相色谱-串联质谱方法。结果：7种FQs药物在5～250ng/mL浓度范围内呈现良好线性关系，相关系数R2均大于0.997；方法检测限为5ng/g，定量限为10ng/g；从10、20和100ng/g3个添加浓度检测结果可以看出，方法平均回收率为80.7%～116%（n=6），批内批间RSD均小于20%。郭伟等[28]采用固相萃取结合超高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术，建立检测鸡肉中7种氟喳诺酮类药物残留的确证分析方法，7种氟喳诺酮类药物在5～100μg/kg浓度范围内线性良好，相关系数R2均大于0.99；以5、25、50μg/kg3个浓度水平进行添加回收率实验，样品的平均回收率在79.2%～108.6%，相对标准偏差为4.2%～8.9%，检出限LOD为0.2～1.4μg/kg。祝曙华等[29]比较了4种商业固相萃取柱（SPE）在超高效液相色谱法（UPLC）检测猪肉中4种氟喹诺酮类药物的应用效果，结果显示在10～100μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数R大于0.999，检出限为0.1～1.3μg/kg，定量限为0.1～4.2μg/kg，三种商品SPE柱均能用于猪肉中4种氟喹诺酮类药物残留检测，而其中1种不能满足检测要求。

2.3.2 毛细管电泳 毛细管电泳法（CE），是以毛细管为分离通道、以直流电场为分离动力，样品中各组分在电场作用下迁移速率（淌度）不同，最终各组分先后通过检测器被检测。由于操作上常用高压直流电场提高分离效率，又称高效毛细管电泳法（HPCE），其分离模式有毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等速电泳（CITP）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管电动色谱（PICEC）、胶束电动毛细管电泳（MGCC）、毛细管等电聚焦（ICE）等[30]。

毛细管电泳不受运行缓冲液的酸碱性和其中的表面活性剂等的影响，具有试剂消耗少、分离模式多、分离效率高等优点，加之近年来出现了毛细管电泳质谱联用（CE-MS）技术，使得检测的灵敏度大大提高，应用前景更加广泛。Gigosos等[31]采用HPCE检测了牛的肾脏、肌肉和鸡蛋等样品中的环丙沙星、二氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、麻保沙星含量，检测限分别为1.0、2.0、1.0、2.0、4.0μg/kg。汪雪雁等[32]等建立了HPCE法同时检测鸡肝中3种FQs药物和2种磺胺类药物残留，5种抗生素在给定条件下10min内完成分离，平均回收率在85.39%～90.32%，相对标准偏差RSD为2.95%～3.41%，相关系数R为0.996 9～0.998 5，标准曲线呈现良好的线性关系。

2.3.3 发光分析法 FQs的发光分析基于氟喹诺酮药物的结构和性质，通过反应使得FQs分子发光或者增敏其他发光分子，再通过发光的光谱强度测定来对FQs定量，分为化学发光分析法（CL）和电化学发光分析法（ECL）两类[33]。

化学发光分析法和电化学发光法设备简单、价格低廉、检测灵敏度高，但都存在对不同种类的氟喹诺酮药物的分析选择性较差的缺点。Schneider等[34]利用FQs和Tb3+复合对DNA发光信号的增强作用对牛血清样品中恩诺沙星药物残留进行检测，在25、50和100ng/mL加标浓度上平均回收率为73.88%，相对标准偏差RSD为11%，最低检测限为2.5ng/mL，未出现假阳性或假阴性结果。Yao等[35]发现了氟喹诺酮类药物和过硫酸共同存在下，电位扫描可产生非常强的电化学发光现象，解释了电化学发光机理，为建立快速、灵敏的FQs电化学发光分析提供了新的路径。Zhou等[36]通过毛细管电泳技术与FQs增敏联吡啶钌电化学发光联用，建立了新的FQs检测方法，对环丙沙星和恩诺沙星的检测限分别为15ng/mL和10ng/mL。

3 结语

本文综述了微生物法、免疫分析法和理化检验法这三大类FQs兽药残留检测方法，分析了各类方法的优缺点和适用范围，在实际工作中应根据FQs兽药残留检测筛选、定量、确证等目的，选择合适的分析方法。随着经济发展和人民生活水平提高，动物源性食品消费量也在迅速增加，FQs类抗生素在动物源性食品生产中应用广泛，残留也较为严重，存在着重大的食品安全隐患。随着食品安全意识的提高，对兽药残留的防控意识也在不断的增强。目前，各国科技工作者对于FQs残留检测进行了大量的研究工作，一些新技术、新方法正积极尝试在兽药残留检测中的应用，如：QuEChERS方法[37]、分子印迹（MIT）、超临界流体萃取（SFE）等前处理方法，以及免疫传感器、生物芯片等检测技术，尤其各类前处理技术的创新和深入，必将推动FQs兽药残留检测技术的方向朝着快速、廉价、准确的方向不断迈进。

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