整树结香法所产沉香的GC—MS分析

廖格 赵美丽 宋希强 梅文莉 杨锦玲 戴好富

摘 要 采用整树结香法诱导健康白木香树结香，并根据树体受伤后木材的颜色形态特征将木材分为腐烂层、沉香层和白木层，运用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分别对三层的乙醚提取物进行了分析。结果表明，不同层化学成分的种类和相对含量上有明显差异。沉香层与腐烂层的2-（2-苯乙基）色酮类成分总相对含量都很高，腐烂层的色酮类成分相对含量（70.25%）高于沉香层（60.08%），但沉香层的色酮种类（14个）比腐烂层（10个）多；倍半萜类成分在沉香层和腐烂层中的相对含量均较低，沉香层的倍半萜类成分相对含量（5.75%）略高于腐烂层（3.75%），而腐烂层的倍半萜个数（11个）略多于沉香层（8个）。白木层则以甾体类化合物为主，没有检出色酮类和倍半萜类成分。

关键词 整树结香法；沉香；GC-MS；2-（2-苯乙基）色酮

中图分类号 O656.22 文献标识码 A

GC-MS Analysis of the Agarwood Produced by

Whole-tree Agarwood-Inducing Technology

LIAO Ge1，2， ZHAO Meili3， SONG Xiqiang1， MEI Wenli2， YANG Jinling1，2， DAI Haofu2 *

1 Horticultural and Landscape College， Hainan University， Haikou， Hainan 572008， China

2 Hainan Engineering Research Center of Agarwood / Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，

Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

3 Jiangxi Chemical Industry School， Nanchang， Jiangxi 330012， China

Abstract In this paper， the agarwood was induced to form in the healthy Aquilaria sinensis with whole-tree agarwood-inducing technology. Then the wood was divided into three sections， which respectively named rotten layer， agarwood layer， and whitewood layer， according to their color and morphological characteristics. The chemical constituents of the three layers were analyzed by using gas chromatography - mass（GC-MS）spectrometry. The results showed that different types and relative content of the chemical components were found in different layers. Compared with the relative content of 2-（2-phenylethyl）chromone derivatives in the agarwood layer（60.08%）， it was more abundant in the rotten layer（70.25%）， however， the former had more 2-（2-phenylethyl）chromone derivatives（14）than the latter（10）. Meanwhile， the relative content of sesquiterpenes was rather low in both the agarwood layer and the rotten layer. The agarwood layer had slightly more content（5.75%）than the rotten layer（3.75%）， while the rotten layer（11）had a little more sesquiterpenes than the agarwood layer（8）. Unlike other two layers， the whitewood layer mainly contains steriods instead of 2-（2-phenylethyl）chromone derivatives or sesquiterpenes.

Key words Whole-tree agarwood-inducing technology； Agarwood； GC-MS； 2-（2-phenylethyl）chromone

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.031

沉香为瑞香科沉香属（Aquilaria）植物中含有树脂的木材[1]。白木香（Aquilaria sinensis）是国产沉香的唯一药源植物，主产于海南、广东等地，具有极高的经济价值[2]。一方面，巨大的经济利益驱使和自然生态环境的破坏导致野生白木香资源急剧减少，白木香现已被载入《中国植物红皮书》[3]及《国家重点保护野生植物名录》[4]；另一方面，天然沉香形成的几率低——“有香者百无一二”[5]，且形成的过程缓慢，使得野生沉香资源供不应求。因此，20世纪70年代初很多学者开始探索人工结香技术，除了传统的砍伤、凿洞、火烧、打钉和半断干法之外，近年来化学法、人工接菌法等新技术也不断应用于研究和生产实践中[6]。

国内外学者对沉香的化学成分研究较多，目前已报道沉香中的挥发和半挥发性成分主要是倍半萜类和2-（2-苯乙基）色酮类化合物[1，7]。近年来关于人工沉香的研究渐热，主要是采用GC-MS联用技术对其进行分析。林峰等[8-9]先后用GC-MS分别对打钉法、砍伤法和凿洞法所产沉香及接菌法半年及一年的沉香进行了分析。陈晓颖等[10]用GC-MS分别对刀砍、钻钉和化学法所产沉香进行了分析。陈怀琼等[11]用GC-MS研究了输液法处理半年得到的沉香、国产野生沉香和健康白木香的挥发油成分。刘洋洋等[12]用GC-MS分别比较研究了通体结香技术处理6个月所得沉香及火烙法、半断干法和接菌法所产沉香的挥发性成分。张兴丽等[13]用半断干法处理白木香后，根据其宏观形态颜色和微观结构分为腐烂层、沉香层、过渡层和白木层，并对不同处理时间不同层的样品进行了GC-MS分析。以上学者的研究表明，不同结香技术、不同结香年限、不同结香部位的人工沉香，其化学成分均有所不同。

本研究所用整树结香法是输液法的一种，是将独特配方的结香剂[14]输入健康白木香树体，从而诱导其结香的方法，也属于化学结香方法。本研究用整树结香法处理健康白木香树，一年后根据白木香受伤后树体的外观形态变化将树干分为3层，分别是：腐烂层、沉香层和白木层，并用GC-MS技术分别对这3层的挥发性成分进行比较分析，以期为整树结香法所得人工沉香的质量评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 美国安捷伦公司的HP6890/5975C GC/MS联用仪，色谱柱为ZB-5MSI 5% Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱；美国BRANSONIC-5510E-DTH超声波清洗仪。试剂：乙醚（分析级），氯仿（色谱级）。

1.1.2 样品 结香所用白木香树为七年生，位于海南省定安县南海农场白木香种植基地，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所戴好富研究员鉴定为白木香（Aquilaria sinensis）；采用本课题组已获国家发明专利授权的“整树结香法”（ZL 2013 1 0150138.5）处理健康白木香树，一年后根据树体受伤后木材的外观形态变化由内而外分为腐烂层、沉香层和白木层（见图1），不同层样品的描述见表1。

1.2 方法

1.2.1 结香方法 在距离地面约45 cm处，与树干保持45度用普通电钻钻孔，钻头直径为0.6 cm，孔深约4 cm。将500 mL配制好的结香剂[配方中不含2-（2-苯乙基）色酮类化合物]通过营养袋缓慢输入钻孔，输完后用橡胶塞封住孔洞，防止雨水冲刷和结香剂流出。

1.2.2 样品制备 用整树结香法处理白木香树后，木材组织最先从钻孔部位开始结香，一年后沿钻孔部位砍下长约15 cm，宽约10 cm，厚约2 cm的木块。根据前人按照外观颜色形态对结香部位的划分，将采集的样品分为腐烂层、沉香层和白木层[13，15]，然后分别晒干后削成小块，精确称取腐烂层1.349 1 g、沉香层0.902 4 g、白木层1.551 9 g，分别用50 mL乙醚在冰水浴下超声提取30 min，静置5 min后过滤得到乙醚提取液。重复提取3次，合并3次提取液，挥干后得到各层的乙醚油状提取物分别为0.054 7、0.053 6、0.037 4 g，根据公式（提取率=提取物质量/样品质量×100%）计算提取率分别为4.05%、5.94%、2.40%。

1.2.3 GC-MS分析条件 色谱条件。色谱柱：ZB-5MSI 5% Phenyl-95% Dimethylpolysiloxane （30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50 ℃，以5 ℃/min升温至310 ℃，保持10 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压7.36 psi，载气流量1.0 mL/min；分流比40 ∶ 1，溶剂：氯仿（色谱级），溶剂延迟时间：4.0 min。

质谱条件。电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 612 V；质量扫描范围m/z 29～500。

2 结果与分析

根据白木香经诱导后的分层结果，用GC-MS技术分别对各层乙醚提取物进行分析，总离子流图见图2。多数化合物通过质谱数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图得到鉴定，而2-（2-苯乙基）色酮类化合物则是根据本课题组总结的质谱特征和裂解规律[16]，再结合文献数据和标准品的质谱图鉴定而得。由表2可知，在整树结香法所得沉香的腐烂层、沉香层和白木层的乙醚提取物中分别检测到46、51、31个色谱峰，并用峰面积归一化法测定了这些色谱峰在样品中的总相对含量之和分别为90.94%、90.67%和87.34%。

在白木层中以甾体类化合物为主，没有检测出2-（2-苯乙基）色酮类和倍半萜类化合物；而腐烂层和沉香层的化学成分则以2-（2-苯乙基）色酮类化合物为主，相对含量分别高达70.25%和60.08%，此外，还含有少量倍半萜类化合物，相对含量分别为3.75%和5.75%。由于倍半萜类成分骨架多变，种类众多，鉴定难度较大，因而有小部分倍半萜类化合物未能鉴定。在沉香层和腐烂层中检测到的15个2-（2-苯乙基）色酮类化合物中，6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮在沉香层和腐烂层中的相对含量都很高，分别为12.75%和19.73%。而据文献报道[1，7，10，17-18]，该化合物在大多数沉香的挥发性成分分析中均有鉴定（相对含量在1.29%～39.11%之间），说明它在沉香中普遍存在。除此之外，还有2-（2-苯乙基）色酮、2-[2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮、6，7-二甲氧基-2-[2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮等都较为常见[9-10，17-19]。

3 讨论与结论

根据GC-MS的分析结果可知，本次实验中整树结香法所得沉香的化学成分以2-（2-苯乙基）色酮类化合物为主，在沉香层和腐烂层中的总相对含量分别高达60.08%和70.25%。近年来，很多学者对人工结香法所得沉香的挥发性成分采用GC-MS技术进行了分析[8-13]，但其中能检测到2-（2-苯乙基）色酮类化合物的报道不多。原因可能是Nist和Wiley质谱库中的2-（2-苯乙基）色酮类化合物的质谱数据有限，以致未能鉴定出色酮类成分。见诸报道的仅林峰[9]从接菌法所得沉香中鉴定出两个色酮，总相对含量为29.12%，及陈晓颖[10]分别从刀砍法、钻钉法和化学法所得沉香中鉴定出色酮，总相对含量分别为22.24%、32.34%和53.11%。

前人报道的奇楠沉香挥发性成分中色酮类成分总相对含量也比较高，在39.30%～95.59%之间[17-19]。此外，杨德兰等[18]研究发现奇楠沉香乙醚提取率达20.3%～40.2%，化合物2-（2-苯乙基）色酮和2-[2-（4-甲氧基）苯乙基]色酮的相对含量之和高达66.47%～84.71%，建议将两者在乙醚提取物中的相对含量之和以及乙醚提取得率作为沉香品质评价的指标之一。而本研究中虽然腐烂层和沉香层的色酮类成分总相对含量分别高达60.08%和70.25%，但是其中2-（2-苯乙基）色酮和2-[2-（4-甲氧基）苯乙基]色酮的相对含量之和仅分别为13.50%和4.26%，且乙醚提取得率较低，仅分别为4.05%和5.94%，因此与奇楠沉香相比还是有明显差别。

对不同层样品乙醚提取物的挥发性成分进行分析可知，白木层、腐烂层和沉香层之间有明显差异。沉香层与腐烂层的2-（2-苯乙基）色酮类成分总相对含量都很高，沉香层中14个色酮类成分的总相对含量为60.08%，腐烂层的10个色酮类成分的总相对含量为70.25%；倍半萜类成分在沉香层和腐烂层中总相对含量均较低，沉香层的8个倍半萜类成分的总相对含量为5.75%，而腐烂层的11个倍半萜类成分的总相对含量为3.75%。另外，2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-2-[2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮、色酮母核有一个甲氧基取代的色酮（出峰时间为44.65 min，取代位置不确定）、色酮母核有一个羟基取代的色酮（出峰时间为46.70 min，取代位置不确定），这4个色酮是沉香层和腐烂层的主要成分，在腐烂层中的相对含量之和为59.33%，在沉香层中相对含量之和为37.70%。

白木层则与沉香层和腐烂层不同，没有检测到色酮类和倍半萜类化合物，而以甾体类、烷烃类和芳香族化合物为主。本次实验首次从白木层中检测出大量甾体类化合物，总相对含量达45.81%。这可能是由于笔者采用了耐高温的色谱柱，能在310 ℃下保持10 min，使得较难挥发的甾体类化合物得以挥发出来并得到鉴定。

整树结香法作为一种新型的结香方法，与传统结香方法相比，具有操作简便，结香品质更好，产量更大，效率更高的优点，具有极大的应用前景。本研究用整树结香法处理健康白木香后，根据树体受伤后木材的外观形态变化进行分层，并分别对其挥发性成分进行了分析，发现腐烂层和沉香层都含有沉香的特征性成分：色酮类和倍半萜类化合物，且腐烂层与沉香层的色酮类成分总相对含量都很高，分别为70.25%和60.08%。一般采收沉香时是将白木和腐烂的木头都剔除掉，但本次实验发现腐烂层有大量色酮类化合物，并不是毫无价值的“烂木头”，可被用于制作线香等。因此在采收整树结香法所得人工沉香时，只需刮除白木部分，腐烂层和沉香层可分别采收用作不同用途。

参考文献

[1] Naef R. The volatile and semi-volatile constituents of agarwood， the infected heartwood of Aquilaria species： a review[J]. Flavour Fragr J， 2011， 26（2）： 73-87.

[2] 田耀华， 原慧芳， 倪书邦， 等. 沉香属植物研究进展[J]. 热带亚热带作物学报， 2009， 17（1）： 98-104.

[3] 傅立国. 中国植物红皮书：稀有濒危植物[M]. 北京：中国科技出版社， 1992： 670.

[4] 国家林业局. 国家重点保护野生植物名录[Z]. 1999.

[5] 寇宗奭. 本草衍义[M]//张丽君， 丁 侃， 校注. 北京： 中国医药科技出版社， 2012： 53.

[6] 黄俊卿， 魏建和， 张 争， 等. 沉香结香方法的历史记载、 现代研究及通体结香技术[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（3）： 302-306.

[7] Chen H Q， Wei J H， Yang J S， et al. Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genus aquilaria plants[J]. Chemistry & Biodiversity， 2012， 9（2）： 236-249.

[8] 林 峰， 梅文莉， 吴 娇， 等. 人工结香法所产沉香挥发性成分的GC-MS分析[J]. 中药材， 2010， 33（2）： 222-225.

[9] 林 峰， 戴好富， 王 辉， 等. 两批接菌法所产沉香挥发油化学成分的气相色谱-质谱联用分析[J]. 时珍国医国药， 2010， 21（8）： 1 901-1 902.

[10] 陈晓颖， 高 英， 李卫民. 不同结香方法与国产沉香挥发性化学成分的相关性研究[J]. 中国药房， 2012， 23（11）： 1 017-1 020.

[11] 陈怀琼. 白木香通体结香技术的初步评价[D]. 北京： 北京协和医学院药用植物研究所， 2011.

[12] Liu Y Y， Chen H Q， Yun Y， et al. Whole-tree agarwood-Inducing technique： an efficient novel technique for producing high-quality agarwood in cultivated aquilaria sinensis trees[J]. Molecules， 2013， 18（3）： 3 086-3 106.

[13] 张兴丽. 伤害诱导的白木香防御反应与沉香形成的关系研究[D]. 北京： 北京林业大学， 2013.

[14] 梅文莉， 戴好富， 王 辉， 等. 一种生产沉香的方法： 中国， ZL 2013 1 0150138.5[P]. 2013-04-26.

[15] 曾幻添， 董文忠， 吴质朴. 沉香的人工沉香[J]. 中草药通讯， 1978（12）： 38-42.

[16] Mei W L， Yang D L， Wang H， et al. Characterization and determination of 2-（2-Phenylethyl） chromones in agarwood by GC-MS[J]. Molecules， 2013， 18（10）： 12 324-12 345.

[17] 梅文莉， 杨德兰， 左文健， 等. 奇楠沉香中2-（2-苯乙基）色酮的GC-MS分析鉴定[J]. 热带作物学报， 2013， 34（9）： 1 819-1 824.

[18] 杨德兰， 梅文莉， 杨锦玲， 等. GC-MS分析四种奇楠沉香中致香的倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮类成分[J]. 热带作物学报， 2014， 35（6）： 1 235-1 243.

[19] Ishihara M， Tsuneya T， Uneyama K. Components of the volatile concentrate of agarwood[J]. J Essent Oil Res， 1993， 3（5）： 283-289.