辐射诱发兰花叶艺突变体的叶片叶肉细胞超微结构观察

苏畅 李枝林 李夏媛 王玉英

摘 要 以未经辐射的全绿植株（TRIR-1）和经辐射诱发叶艺兰植株（TRIR-2）的叶肉细胞为试材，对其全绿植株叶片的正常绿色区、辐射诱变植株叶片的绿色区（TRIR-2′）和白色区（TRIR-2″）叶片叶肉细胞进行细胞超微结构观察。结果表明：（1）TRIR-1叶肉细胞中叶绿体数量最多，TRIR-2′次之，TRIR-2″中无成熟完整的叶绿体；（2） TRIR-1叶肉细胞中的线粒体呈椭圆颗粒状，TRIR-2′中的线粒体外膜破裂、线粒体溶解、嗜锇颗粒数量最多，TRIR-2″中有少量外膜完整的线粒体；（3）TRIR-2″部分叶肉细胞中无细胞器，只有少量细胞质。说明经辐射诱变叶艺兰与未经辐射植株叶肉细胞结构存在差异。

关键词 黄色素花虎头兰 ；黄蝉兰 ；叶肉细胞 ；超微结构 ；叶绿体 ；线粒体 ；辐射诱变

分类号 S682.31 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.03.006

Abstract The test materials of this study are mesophyll cells which take from cymbidium without induced by irradiation （TRIR-1） and new mutants induced by irradiation （TRIR-2）， including normal green area from TRIR-1 and both green area （TRIR-2′） and the white area （TRIR-2″） from TRIR-2. Ultrastructure of mesophyll cells were observed by Transmission Electron Microscope （TEM）. The results showed that： （1） In the mesophyll cells， the quantity of chloroplasts in TRIR-1 was the most， the quantities of chloroplasts in TRIR-2′ and TRIR-2″ were less. There are not even a little bit mature and complete chloroplast in the mesophyll cells of TRIR-2″； （2） The mitochondria in cell of TRIR-1 showed ellipsoid，mitochondrial membrane ruptured and mitochondria dissolved in TRIR-2′ the content of osmophilic gramules is the most in the cell of TRIR-2′， a small amount mitochondria with intact membrane appeared in TRIR-2″； （3） There is nothing but a few cytoplasm in some cell of TRIR-2″. This shows that some difference between the cymbidium without induced by irradiation and new mutants induced by irradiation in cell ultrastructure.The result can provide evidence for variety breeding of Cymbidium with verge line pattern lives.

Keywords Cymbidium tracyanum ； Cymbidium iridioides D. Don ； mesophyll cells ； ultrastructure ；chloroplast ； mitochondrion ； radiation mutagenesis

兰花是中国传统名贵花卉。叶艺兰（线艺兰）是指兰属（Cymbidium）植株叶片上镶嵌着或金黄、或银白、或浓绿、或朱红、或墨黑的嘴、边、点、线、斑的中国兰统称[1]。叶艺兰栽培已有千年，因其叶片艳丽，形态优美，被誉为“花中君子”，是珍贵的观赏花卉[2]。叶（线）艺品种以墨兰最多，剑兰次之，春兰、蕙兰与寒兰较少[3]。艺象主要表现为：金棱边类、绿艺类、先明后暗类（全斑类）、钳帽子类、爪艺类、水晶类、斑缟类（现明，后明）、棒缟类（现明，后明）、图斑艺类、虎（豹）斑类等[4]。

辐射诱变育种是一种常用的育种方法，具有创造多种突变体、丰富种质资源库，打破基因连锁、提高重组率，保持优良性状、改良品种的某些不良性状，以及突变性状稳定快、缩短育种年限等特点，γ射线仍是植物诱变育种中最常用的辐射诱变因素[5]。彭绿春等应用60Coγ射线处理碧玉兰、西藏虎头兰、冬凤兰、竹叶兰的组培苗，获得了植株矮化、变粗、叶变宽、叶上有淡绿斑等较明显的表型变化[6]，蒋彧等用60Coγ辐射兰花春剑隆昌素根状茎，分化苗的主要变异性状是叶色失绿变淡[7]。目前，已有对甜叶菊[8]、三七[9]和冬小麦[10]等的辐射处理后的叶片细胞的超微结构观察的报道，但尚无兰属植物辐射处理后的植株细胞超微结构的相关研究。本研究以本课题组经辐射诱发的叶艺兰与未经诱变的全绿植株为试材，通过对植物细胞电镜观察，以期从细胞超微结构方面阐述植株的差异性，为叶艺兰品种选育和辐射诱发叶艺兰机理研究奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为TRIR-1和TRIR-2植株的组培苗（图1）。将黄色素花虎头兰（Cymbidium tracyanum）与黄蝉兰（Cymbidium iridioides D. Don）杂交，获得F1杂交苗，之后通过外观形态筛选出性状稳定、一致的F1代株系（TRIR-1），在云南华源辐射有限公司进行60Coγ射线剂量23.6 Gy，剂量率为1 Gy/min，急性照射后，培育2 a，发现数株叶艺株系，再经过6 a的组培培养，继代10次后，获得观赏价值较高、叶形较为优美、个性状稳定的叶艺兰新品系，命名为TRIR-2。

1.2 方法

取未经辐射处理正常的叶片（TRIR-1），叶艺植株叶片的绿色区（TRIR-2′）与白色区（TRIR-2″），切成0.5 mm×5 mm 的片段，在戊二醛4℃条件下固定4 h，用618环氧树脂包埋[11]，在Leica-R 超薄切片机中切片，切片厚度为50 nm，经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min[12]。于日本JEOL 公司的JEM-1011 型透射电镜，加速电压100 kv左右，观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 全绿植株叶片叶肉细胞（TRIR-1）的超微结构

TRIR-1的叶肉细胞中细胞质丰富、叶绿体数量较多且呈梭形（图2-A），叶绿体结构复杂，外被膜完整，内部片层系统排列有序（图2-C）；线粒体形状为椭圆颗粒状，体积比叶绿体小，线粒体嵴较丰富，线粒体多位于两个相邻叶绿体之间（图2-B）。叶绿体上含有较少的嗜锇颗粒。

2.2 叶艺叶片绿色部位叶肉细胞（TRIR-2′）的超微结构

TRIR-2′的叶肉细胞壁光滑（图3-A）、叶绿体呈梭形（图3-B、3-C），叶绿体数量较少，叶绿体结构较简单，外被膜完整，内部片层系统排列较差，分层现象不明显（图3-C）；线粒体有溶解现象（图3-B）。叶绿体上含有较多嗜锇颗粒。

2.3 叶艺叶片白色部位叶肉细胞（TRIR-2″）的超微结构

TRIR-2″的叶肉细胞中没有正常的成熟叶绿体，只有发育初期的原质体，有的原质体被膜完好，多变形膨大，基粒叠垛程度低，基本看不出内部片层系统（图4-B）；有的原质体外被膜局部破裂，基质外流，内部只见残存的膜结构（图4-C），有些叶肉细胞中有线粒体（图4-C），有些叶肉细胞内没有发现任何细胞器，只有细胞壁和极少量的细胞质（图4-A）。

TRIR-2′叶肉细胞与TRIR-1叶肉细胞的超微结构内含细胞器的类型基本一致，TRIR-2′叶肉细胞与TRIR-1叶肉细胞中，叶绿体均呈梭形，TRIR-2′叶肉细胞的线粒体多位于两个叶绿体之间，从图上看来每两个叶绿体之间线粒体的数量相差不大，但叶绿体有一定差别，TRIR-2′叶肉细胞的叶绿体数量明显少于TRIR-1，TRIR-2′叶肉细胞的叶绿体分层现象比TRIR-1叶肉细胞的叶绿体差，且TRIR-2′叶肉细胞的叶绿体上的嗜锇颗粒比TRIR-1叶肉细胞的叶绿体多；TRIR-1叶肉细胞与TRIR-2″叶肉细胞的线粒体外膜均较完整，但TRIR-2″叶肉细胞中线粒体多分布在细胞质中，且数量少于TRIR-1叶肉细胞的线粒体，TRIR-2″叶肉细胞中没有成熟完整的叶绿体，只有发育初期的原质体，有的TRIR-2″叶肉细胞甚至未发现细胞器；TRIR-2′叶肉细胞的线粒体外膜破裂，线粒体溶解，TRIR-2″叶肉细胞的线粒体外膜完整，TRIR-2″叶肉细胞中原质体上没有发现嗜锇颗粒，TRIR-2′叶肉细胞的叶绿体上有较多嗜锇颗粒。

3 结论与讨论

叶绿体和线粒体在植物细胞能量代谢上极具重要性。线粒体是有氧呼吸和形成ATP的主要场所，叶绿体是光合作用的场所[13]。辐射诱变的细胞学效应主要表现在植物细胞和染色体结构方面的变异[14]。罗茂春等用碳离子注入甜叶菊种子后出现萌发迟缓、生长速度变慢、叶绿体发育减慢和叶绿体膜被破坏等现象[8]。有研究表明，由于叶绿体内膜系统被破坏，类胡萝卜素呈现出来，嗜锇颗粒也大量产生[15]。有研究发现在未受辐照情况下，三七叶片细胞形态规则，细胞内叶绿体数量多，基粒片层、基质片层多且有序，光合作用能力强，线粒体形态饱满，双层膜完整，管状内嵴清晰可见，基质浓厚；辐照后，线粒体数目明显减少[9]。有研究证实，经辐照的叶片细胞细胞内容物减少，一些细胞的细胞器消失，受辐照的叶片细胞中叶绿体比正常的小且数目减少，发育异常，叶绿体结构发生变化，由典型的凸透镜状转变为长形、圆形、亚铃形或不规则形[10]。本研究结果也表明，未辐射植物叶片细胞形态规则，细胞内叶绿体数量多，线粒体形态饱满，双层膜完整，基质浓厚；而辐射诱发的突变体叶艺兰植株叶片的绿色区的细胞中的叶绿体数量减少、肿胀变形，片层结构模糊，部分线粒体外膜破裂、溶解，嗜锇颗粒增多，而白色区细胞中无成熟叶绿体，有少量外膜完整的线粒体。此外，本研究发现，辐射诱发的突变体叶艺兰叶片白色区细胞中的少量外膜完整的线粒体分布于原质体细胞质中，并非介于两个相邻叶绿体之间。相关研究表明，细胞中植物的线粒体在能量转换中起着其他细胞结构无法取代的作用[16]。因此，本研究推测辐射诱发的突变体叶艺兰植株光合作用的产生和能力转换主要来源于叶片的绿色区。

参考文献

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