姜科植物染色体制片方法的优化

涂红艳 张爱玲 肖望 陈丹 曾海敏

摘 要 以白姜花根尖为材料，通过预处理、固定、解离和染色等步骤，对染色体制片技术进行改良，得到了一种简单高效的可用于植物染色体数目分析的制片技术，主要步骤包括“取材-酸解离-低渗-染色-压片”。采用改良技术得到的制片细胞膨大、染色体分散、形态清晰、分色良好。用该方法对白姜花、金姜花、所罗门姜黄和红艳郁金等的体细胞染色体数目进行检测，结果分别如下：白姜花2n=34，金姜花2n=34，所罗门姜黄2n=63，红艳郁金2n=49。

关键词 白姜花；染色体制片；染色体数目

中图分类号 Q949.718.33 文献标识码 A

Abstract Plant chromosome analysis technology is the most common and useful method in cytogenetics research. In the present study，three methods for plant chromosome preparation of Hedychium coronarium were compared including material pretreatment，fixation，dissociation and dyeing on the root tips. The results showed that the best experimental protocol for chromosome number analysis was ‘sample selection，acid dissociation，hypotonic，staining with improve phenol fuchsin，chromosome slide preparation，and the best dissociation way was with 37% HCl ∶ 95% C2H5OH=1 ∶ 3 at 28-30 ℃ for 6 min. Clear metaphase chromosome images with large cells，spreading and clear chromosome were obtained with the improved method. Subsequently，this method was applied to analyze the somatic chromosome numbers of H. coronarium，H. gardnerianum，Curcuma soloensis，Curcuma rubescens at metaphase，which were 2n=34，2n=34，2n=63，2n=49 respectively.

Key words Hedychium coronarium；Chromosome preparation；Chromosome number

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.026

姜科（Zingiberaceae）植物是热带、亚热带的特有植物，全世界约有50属1 500种[1]，其中中国约19属143种，主要分布在西南部至东部，姜科植物具较好的药用、香料、调味、观赏等价值，且资源丰富[2]。

植物染色体制片技术是植物细胞遗传学、染色体工程、植物细胞生物学、植物细胞分类学等学科的基本实验技术。植物染色体的数目、组型分析对于研究植物的分类、起源和演化都有重要的意义[3]。目前对国产姜科植物的染色体研究已开展了很多[1，4-5]，但仍有很多种类尚未有染色体资料或者结论多样。以白姜花（Hedychium coronarium）为例，不同学者对其染色体数目进行分析得出不同的结果，分别为34[4，6-8]、51[9]、54[10]。结果的不同可能与取材和实验方法有关。目前国内外常用的染色体制片技术为2种，分别是压片技术和去壁低渗干燥技术。压片技术操作快速简单，但制片得到的染色体多交联重叠，如胡秀等[7]以根尖为材料，利用压片技术对白姜花染色体数目进行分析，发现即使制片图像良好，也总是有几条染色体相互贴近，难于对其进行准确的计数。采用去壁低渗干燥技术制片，染色体分散性好，但操作繁琐、技术要求高，如陈瑞阳[8-9]以白姜花根尖为材料，结果得到分散性好的染色体图谱。

本研究分别以姜科植物白姜花（Hedychium coronarium）、金姜花（Hedychium gardnerianum）、 所罗门姜黄（Curcuma soloensis）和红艳郁金（Curcuma rubescens）根尖为材料，将去壁低渗干燥技术中的后低渗程序结合到压片技术中，同时结合优化的解离方法，旨在建立一种适合于姜科植物染色体数目分析的改良制片技术，为姜科植物的遗传育种提供细胞学研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料白姜花购自广州芳村岭南花卉市场，将其根状茎埋于沙土中进行催根；所罗门姜黄、金姜花和红艳郁金采自广州市农业技术推广中心，将其种植于本课题组试验田，取根状茎埋于沙土中进行催根。

1.2 方法

1.2.1 取材 上午9∶00～10∶30，分别取白姜花、金姜花、所罗门姜黄、红艳郁金的白嫩根尖泡于冰水混合物中，带回实验室，洗干净后用于制片。

1.2.2 常规制片技术 具体步骤及方法见表1[11]。

1.2.3 去壁低渗干燥技术 具体步骤及方法见表2[8]。

1.2.4 改良的制片技术 将去壁低渗干燥技术的后低渗程序加入到压片技术中，具体方法见表3。

1.2.5 不同解离液对制片的影响 配制不同成分的解离液，研究解离液的组成和解离温度对制片的影响，解离液的组成见表4。

2 结果与分析

2.1 不同方法所得白姜花染色体制片比较

利用常规的压片技术进行制片，解离后材料较硬，细胞很难分散开，无法把细胞压到同一个平面，因此也无法制得能观察到染色体的清晰图像（图1-A）。采用去壁低渗干燥技术时，经酶解去壁、低渗干燥后能制得分散性好的染色体装片，且染色效果好，制得的图片染色体图像清晰（图1-B），但该技术操作程序复杂，技术难度大，耗时长，耗材昂贵。利用改良制片技术简单快速、耗材少，但实验效果与去壁低渗干燥技术相当，细胞较为膨大，染色体分散性好，且形态清晰、分色良好，细胞能轻易被压到同一平面（图1-C）。

2.2 不同解离方法对白姜花细胞大小和染色体分散程度的影响

对不同解离方法得到的白姜花细胞大小和染色散开区域大小的数据分别进行差异性分析。结果显示（表5），采用方法B、C、D，即解离液中37%HCl与95%乙醇的比值为1 ∶ 1、1 ∶ 2与1 ∶ 3时，实验结果没有显著差异；但采用方法E、F，即解离液中37%HCl与95%乙醇比值为1 ∶ 4、1 ∶ 5时，与采用方法D（比值为1 ∶ 3的解离液）的实验结果存在显著差异。解离液中37%HCl与95%乙醇的比值为1 ∶ 3时，解离效果最好，制片质量最高。对比常规方法A（即解离液组成为1 mol/L HCl，于60 ℃解离6 min），方法D[即解离液中37% HCl与95% 乙醇比值为1 ∶ 3，于常温（28～30 ℃）下解离6 min]所得的细胞体积扩大到原来的1.5倍，染色体分散区域扩大了1.6倍（表5），这表明解离液的组成以及解离方法会直接影响到制片的效果。

不同的解离方法所得到的实验效果存在明显的差异。6种解离方法中，白姜花染色体制片的最适解离方法为D，即37% HCl与95%乙醇比值为1 ∶ 3，制片得到的细胞较大，染色体染色深、分散性好，容易被压在同一平面，且结构完整、着丝点清晰可见（表5，图2-D）。白姜花的染色体数为2n=34，这与之前几位学者的研究结果相符[4，6-8]。

在浓度较高的HCl下解离，细胞壁被分解软化，低渗后细胞膨胀较明显（图2-B、C、D），染色体分散。但HCl浓度太高，易导致染色体断裂成小片段（图2-B），无法准确判断染色体的数目。而采用低浓度HCl时，无法使细胞壁软化，染色体很难被压到同一平面（图2-A），染色体多重叠交联、分散性差（图2-E、F）。

2.3 改良制片技术获得的几种姜科植物染色体数目

分别利用改良制片技术对金姜花、所罗门姜黄和红艳郁金的染色体数目进行研究，均获得了分散度高、染色清晰的图像，如图3所示。从实验结果分析可知，金姜花的染色体数目为2n=34（图3-A），所罗门姜黄的染色体数为2n=63（图3-B），这与Skornickova等[12]的报道一致；红艳郁金的染色体数目为2n=49条（图3-C）。

3 讨论与结论

染色体压片技术是以人工外加的机械压力而使染色体分散[11]，去壁低渗干燥技术是以酶分解细胞壁，再用低渗液使细胞吸胀，经火焰干燥时借用水的表面张力使染色体分散开[8]。本研究在常规压片技术的基础上加入了去壁低渗干燥技术中的低渗程序，目的是使细胞吸水膨胀，染色体分散到细胞质中，制片时便于使染色体分散开。在解离过程中，HCl起到分解细胞壁的果胶物质和部分细胞质的作用，从而使细胞易于分散，同时，HCl也可以使细胞壁适度软化便于压片。用HCl解离除了成本低外，解离后还能使细胞保留部分细胞壁成分，确保细胞不会因低渗过度而胀破并影响染色体的分辨。但是HCl对细胞壁的软化程度直接影响到低渗的效果，浓度过高时容易导致染色体严重受损甚至完全分解；浓度过低又使细胞难以分散，导致低渗没有任何效果。本研究采用添加乙醇的方法对HCl解离的最适浓度进行了梯度设计和分析，得到了最适合用于酸解的HCl与乙醇的比例。

在改良制片技术中采用了改良苯酚品红染液，其具有染色快、着色深、适应性广的特点，适合于多数植物根尖、幼芽、花药以及细胞愈伤组织染色[13]。同时，由于其本身也是固定液，因此省去了固定材料的程序。经固定的材料，细胞更松软，更便于压片。

采用去壁低渗干燥法制片需要通过预处理获得较多的中期分裂相，以促进染色体的收缩，使染色体变得短而粗。之前姜科植物染色体制片中多采用预处理这一步骤，如陈瑞阳[8]用秋水仙素预处理白姜花根尖3.5 h，Skornickova等[12]用二氯苯饱和溶液预处理姜黄根尖3 h，李维秀等[5]用8-羟基喹啉预处理10种姜科植物根尖4 h。上述预处理所耗时间较长，且预处理药物浓度使用不当会对细胞产生毒害作用，如秋水仙素会引起多倍体的产生，8-羟基喹啉会引起染色体排列紊乱。本研究采用的改良制片技术，去除了预处理这一步骤，直接取材、酸解离、低渗、染色和压片，方法简便快速，并减少了对细胞的毒害作用，但实验效果与去壁低渗干燥技术相当，且细胞膨大、染色体分散性好、形态清晰、分色良好。

根尖染色体计数是鉴定植株染色体数最常用最可靠的方法之一。胡秀等[7]利用小孢子母细胞为材料对白姜花进行染色体分析，从实验材料方面对白姜花的染色体数目研究方法进行了改良。但植物的染色体数一般以体细胞染色体数目为准，处于减数分裂期的细胞， 由于价体分析难以保证准确，所以，除苔鲜和蕨类等因材料所限而用减数分裂细胞计数染色体外，针对其他植物，则一般只宜将其作为辅助计数材料[14]，利用根尖进行染色体计数仍然是最理想的方法。

参考文献

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