UPLC—MS/MS法同时检测5种PDE5 型抑制剂的研究

张艳萍 钱鑫 李翠玲

【摘要】目的：建立同时测定壮阳类中成药和保健品中可能添加的5种5型磷酸二酯酶（PDE5）型抑制剂UPLC-MS/MS分析方法，方法：采用液质联用法 ，应用C18柱，流动相为含0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脱，质谱采用正离子模式，多反应监测扫描。 结果：5种PDE5 型抑制剂线性关系、精密度均符合方法学测定要求，加标回收率为80.8%～101.9%。结论：该法操作简便、快捷、高灵敏度、高准确性等特点，可同时对中成药和保健食品中非法添加多种PDE5 型抑制剂进行定性定量分离检测。

【关键词】UPLC-MS/MS；壮阳类中成药；保健食品；PDE5 型抑制剂

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2016）07-0021-02

Abstract：Objective To establish a UPLC-MS/MS analytical method for the simultaneous analysis of five PDE5 inhibitors in Chinese trandition medicines and Health Food.Methods The separation was performed on C18 column using a gradient elution（0.1% formic acid in water and acetonitrile）. A triple quadrupole mass spectrometer operating in positive electrospray ionization mode with multiple reaction monitoring was used.Results five PDE5 inhibitors have good linear relationship and precision according to the requirements of the methodology determination. The recoveries were 80.8%～101.9%.Conclusion the method not only isconvenient，rapid，sensitive and accurate ，but also can be used to separate and detect a variety of PDE5 inhibitors qualitatively and quantitatively in illegally added into anti-importence Chinese trandition medicines and health food at the same time .

Keywords：UPLC-MS/MS；anti-impotence Chinese trandition medicines；health food；PDE5 inhibitor

近年来，一些不法商贩利欲熏心，不择手段，在宣传具有抗疲劳功效的中成药和保健食品中非法添加化学药品，其中以添加西地那非、他达那非和伐地那非这3种药物较为常见[1]，在没有医师指导的情况下，长期大量服用这种非法添加了“壮阳”药物成分的中成药和保健食品，有可能对身体造成极大损害。若服用过量，极易引发毒副作用，會出现头晕、昏晕、甚至青光眼，造成对肾功能、心脏功能、心血管疾病的严重损害。目前，中成药和保健食品中非法添加壮阳药物检验方法主要有液相色谱法[2-4]和液质联用法[5-6]，国家食品药品监督管理局颁布了药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号2009030补肾壮阳类中成药中PDE5 型抑制剂的快速检测方法，主要采用理化反应法、液相色谱和液质联用（一级、二级扫描法）来对中成药和保健食品中非法添加的PDE5 型抑制剂进行定性。而本文采用UPLC-MS/MS多反应检测方法对中成药和保健食品中非法添加的那红地那非、红地那非、西地那非、硫代艾地那非、伪伐地那非进行定性和定量，该方法具有准确、可靠、灵敏度更高，可为分析检测中成药和保健食品领域的打假行动提供准确可靠的技术保障。

1 仪器与试剂

美国Waters xevo TQ 三重四级杆液质联用仪；美国MS2漩涡振摇器；瑞士梅特勒-托利多AB265-S电子天平；昆山KQ-250B超声波清洗器。对照品那红地那非（批号520039-201401）、红地那非（批号520039-201401）、枸橼酸西地那非、硫代艾地那非（批号250048-201401）、伪伐地那非（批号520041-201401）购自中国食品药品检定研究院，各对照品质量分数均≥98%；乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的配制

2.1.1 对照品混合标储备溶液的制备 分别称取上述5种对照品各约10mg，加乙腈溶解并定容至20ml容量瓶，浓度为0.5mg/ml的对照品单标储备溶液。

2.1.2 对照品混合标准中间液的制备 精密量取各单标物质适量，用20%乙腈溶液稀释成不同浓度的混合中间标准溶液，其浓度范围为0.2～5.0μg/ml。

2.1.3 对照品混合使用溶液系列的制备 准确吸取混合标准中间液0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml至5ml容量瓶，用20%乙腈水溶液定容，配制浓度范围为0.004～0.50μg/ml的标准混合工作溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取供试品约0.50g于25ml容量瓶中，加20%乙腈水溶液定容，旋涡振荡2min后，超声处理15min，过滤，取上清液过0.22μm微孔滤膜，待测，如样品浓度超出线性，需对供试品溶液进行适当稀释。

2.3 色谱与质谱条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1×100mm，1.7μm），流动相为乙腈 （A）-含0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0.0min，20% A；0.0～4.9min，20%～ 70%A；4.9～5.0min，70%～95%A；5.0～7.0min， 95%A； 7.0～7.1min ，95%～ 20%A； 7.1～10min ，20% A； 柱温：40℃， 流速：0.30 ml/min， 进样量：1μ1。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子检测，离子源温度： 150℃，毛细管电压：3.5KV，脱溶剂温度：500℃，锥孔气流量（氮气）：50L/h；碰撞气流速（氩气）：0.15 L/h，多反应监测（MRM），其各物质母离子、定量离子、锥孔电压、碰撞电压见表1，MRM 离子流图见图1。

2.4 标准曲线与线性试验 取各浓度混合标准工作溶液进液质联用仪，以峰面积对浓度做标准曲线，进行线性回归分析，各物质浓度在各自浓度范围内线性良好。按照样品称样量0.5g，定容10ml，以仪器3倍噪声值表示方法检出限，10倍噪声值表示方法定量限来计算，结果见表2。

2.5 方法精密度和回收率实验 向一份未检出上述5种PDE5 型抑制剂的中成药中添加低、中、高3种不同浓度的混合标准溶液，按2.2进行样品处理，经液质联用仪测定，计算精密度和回收率。结果表明：5种PDE5 型抑制剂加标回收率为80.8%～101.9%， RSD为2.0%～5.1%，均能满足方法学要求。结果见表3。

2.6 方法应用 在本实验条件下，对监督抽验的市售42批中成药和25批保健食品进行上述5种PDE5 型抑制剂的检测，在20份中成药和17批保健食品中检出西地那非，含量为34.1～956.4mg/kg，检出率为55.2%。

3 讨论

本实验选择了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液系统，考察了不同的流动相系统对物质分离、色谱峰拖尾等影响，结果发现，在流动相中添加甲酸可以提高ESI电离源正离子检测方式下的质谱响应，有利于改善峰形，且分离效果最好，最终确定流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液系统，尝试不同的流动相比例的梯度程序，确认使用前述梯度条件，各物质峰型较好，并在6min内5种物质能分离完全。同时为减少溶剂效应，提取溶剂选择20%乙腈水溶液。

本实验考察了不同类型不同长度的色谱柱，最终选择waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），其保留時间适中，具有较好的分离效能，不易受到干扰。由于中成药和保健食品成分复杂，存在众多干扰物质，单纯采用HPLC法较难将待测物质与干扰物质完全分离，本实验建立的UPLC-MS/MS多反应检测方法可同时用于中成药和保健食品中非法添加的壮阳类药物的定性和定量检测，分析方法灵敏，线性范围宽，精密度高，回收率好，这些因素保证该法用于中成药和保健食品中PDE5 型抑制剂的分析能排除背景干扰，为打击中成药和保健食品中非法添加PDE5 型抑制剂的监督检验提供技术保障。

参考文献

[1] 龙凌云 ，李涛 ，邓永琪 ，等.HPLC-MS/MS法同时检测抗疲劳保健食品中非法添加的8种壮阳类化合物 [J]. 农产品加工（下），2015，10（6）：45-47.

[2] 戚亮，崔琳.HPLC法测定枸橼酸西地那非的含量[J]. 黑龙江医药， 2013，26（5）：755-757.

[3] 刘志刚，罗新根，赵树进.HPLC测定万艾片中枸橼酸西地那非含量[J].华南国防医学杂志，2010，24（4）：248-249

[4] 魏尊喜. HPLC与TLC法测定保健品总枸橼酸西地那非含量[J].安徽医药， 2007，11（12）：1097-1098

[5] 向智敏，张骊，祝明，等. HPLC和LC-MS/MS鉴定锁阳固精丸中非法添加的西地那非衍生物[J]. 中国现代应用药学，2010，（2）：167-171.

[6] 赵维，冉兰，魏伯平，等.HPLC-TOF/MS检测补肾强身胶囊中西地那非和他达那非[J]. 药物分析杂志， 2008，28（10）：1692-1697.

（收稿日期：2016.02.01）