RNA干扰沉默Ghrelin基因对仔猪胃酸分泌的调节作用

杜改梅 胡志华 罗碧平 吴结革 张淼 晏文梅 刘茂军

摘要：【目的】研究生长素（Ghrelin）基因沉默对仔猪胃酸分泌的调节作用，为防治仔猪断奶后某些消化系统功能障碍或分泌异常研究提供新靶点，进而阐明Ghrelin对胃酸分泌的调节作用机制。【方法】采用脂质体将RNA干扰沉默的shGhrelin转染体外培养的猪胃黏膜上皮细胞，优化确立最佳转染条件，并通过荧光定量RT-PCR检测shGrelin转染对胃黏膜上皮细胞中Ghrelin基因mRNA表达及H+-K+-ATPase（质子泵）活性的影响。【结果】质粒（shGhrelin）与脂质体（Lipofectamine 2000）的最佳转染比例为1∶3，最佳转染时间24 h。与正常对照组相比，以shGhrelin转染胃黏膜上皮细胞后，其Ghrelin基因mRNA的表达显著降低（P<0.05，下同），H+-K+-ATPase活性也显著下降。【结论】采用RNA干扰技术能沉默胃黏膜上皮细胞Ghrelin基因表达和抑制H+-K+-ATPase活性，表明Ghrelin对胃酸分泌具有重要的调节作用。

关键词： 生长素（Ghrelin）；胃黏膜上皮细胞；胃酸分泌；RNA干扰

中图分类号： S828 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1396-05

Abstract：【Objective】The regulating effect of Ghrelin gene silencing on gastric acid secretion were investigated， in order to provide new target for digestive system dysfunctions or diacrisis of weaning piglet， and then clarify regulation mechanism of ghrelin in the gastric acid secretion. 【Method】shGhrelin was transfected into in vitro porcine gastric mucosal cells using liposome， and the transfection conditions were further optimized. The effects of shGhrelin transfection on Ghrelin gene mRNA expression and H+-K+-ATPase（proton pump） activity were detected by fluorescent quantitative RT-PCR. 【Result】The results showed that， the optimal transfection ratio of plasmid（shGhrelin） to lipofectamine 2000 was 1∶3， and the optimal transfection time was 24 h. Furthermore， after shGhrelin was transfected into in vitro porcine gastric mucosal cells， Ghrelin gene mRNA expression and H+-K+-ATPase activity were reduced significantly（P<0.05）， compared with control group. 【Conclusion】Ghrelin gene expression is silenced successfully by using RNA interference（RNAi） technology， and H+-K+-ATPase activity is inhibited. It indicated that ghrelin plays an important role in regulating gastric acid secretion.

Key words： Ghrelin； gastric mucosal cell； gastric acid secretion； RNA interference

0 引言

【研究意義】在消化系统中，胃是蛋白质消化的重要场所，也是抵御有害微生物入侵的重要屏障。胃黏膜组织中壁细胞分泌的胃酸对胃蛋白酶原激活起关键作用，同时具有抑制有害菌增殖的作用。随着养猪业规模化的不断发展，仔猪断奶日龄越来越小，但其胃肠道功能发育尚未完善，常导致仔猪食欲不良、消化功能紊乱，严重的甚至出现腹泻或死亡现象等，严重影响我国养猪业的健康快速发展（张宏福和顾宪红，2001）。因此，有效激发仔猪内源性的胃酸分泌能力，提高断奶前后仔猪的消化功能是防止其断奶后腹泻的关键。【前人研究进展】生长素（Ghrelin）是一种主要由胃粘膜分泌的短肽，与受体结合可发挥许多生物学功能（Kojima et al.，1999，2008；Date et al.，2000；Muller et al.，2015）。Ghrelin免疫活性细胞主要分布在胃底部泌酸腺黏膜上（Date et al.，2000），将胃部的泌酸区切除后，机体的血清Ghrelin含量显著下降（Ariyasu et al.，2001）。Ghrelin基因在胃底和幽门部均有表达，但在胃底部的表达量显著高于幽门部（杜改梅等，2005）。近年来，有关Ghrelin及其受体的研究主要集中在人类和鼠类上，并证实胃肠道功能与Ghrelin间存在密切关系，但有关Ghrelin对胃功能发育的影响作用尚有不同观点。部分研究揭示，Ghrelin可降低应激对小鼠胃肠道黏膜的损害作用，并促进胃肠蠕动及食物消化（陈晨，2002；黄希贵等，2004；Levin et al.，2005），或促进大鼠胃肠运动和胃酸分泌（Masuda et al.，2000）；但也有研究表明，Ghrelin对大鼠胃酸分泌具有显著的抑制作用（Sibilia et al.，2002）；而Dornonville等（2004）研究发现，Ghrelin对胃肠道运动具有促进作用，但对胃酸分泌无任何促进或抑制作用。即关于Ghrelin对胃酸分泌的调节作用尚无定论，有待进一步研究阐明。【本研究切入点】RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种负责转录和转录后基因沉默机制（Calero- Nieto et al.，2009），目前已成为研究基因功能的一个重要工具，在许多疾病的预防和治疗中得到推广应用（Rao et al.，2009）。因此，研究RNA干扰沉默Ghrelin基因对仔猪胃酸分泌的影响，对阐明其调节作用机制具有重要意义。【拟解决的关键问题】通过RNA干扰沉默Ghrelin基因表达，研究Ghrelin调节胃酸分泌的作用，以期为防治仔猪断奶后某些消化系统功能障碍或分泌异常研究提供新靶点，进而阐明Ghrelin对胃酸分泌的调节作用机制。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

H+-K+-ATPase Kit和胰蛋白酶（Trypsin）购自南京建成生物科技有限公司，DMEM/F-12和Triton X-100购自美国Gibco公司，胎牛血清、Rabbit Monclonal to CK18和FITC标志亲和纯化羊抗兔IgG（H+L）购自美国Sigma公司，Trizol试剂盒和SYBR-Green I购自TaKaRa公司，质粒pGPU6/GFP/Neo购自GenePharma公司；无内毒素质粒抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 胃黏膜上皮细胞培养

迅速剖取断奶小梅山猪的胃，用含青霉素（500 U/mL）和链霉素（500 U/mL）的预冷（4 ℃）D-Hanks液快速清洗胃内容物，充分洗净后迅速剥离胃黏膜，参照Terano等（1982）的方法进行胃黏膜上皮细胞培养。0.15%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，过铜网后1000 r/min离心5 min；D-Hanks液洗离心沉淀1次，同样方法离心收集沉淀，用含10%胎牛血清、青霉素（500 U/mL）和链霉素（500 U/mL）的DEME/F-12悬浮沉淀，制成细胞悬液，确保细胞存活率在95%以上。调整细胞密度为2×106个/mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至细胞融合达80%。

1. 3 胃黏膜上皮细胞免疫荧光鉴定

消化分离生长良好的黏膜上皮细胞于96孔板中贴壁生长24 h，弃培养液，PBS洗3次，每次5 min；于200 μL乙醇中4 ℃固定30 min，PBS洗3次；用1% BSA在37 ℃下封闭30 min，PBS洗3次；加入Rabbit Monclonal to CK18（一抗），37 ℃下孵育1.5 h，PBS洗3次；加入FITC标志亲和纯化羊抗兔IgG（二抗），37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗3次。荧光显微镜下观察并拍照，阳性信号为绿色荧光。

1. 4 shGhrelin转染

转染前1 d，将细胞接种至6孔板中（培养液为不含抗生素的DMEM/F-12），37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%融合时进行转染试验。按照Lipofectamine 2000使用说明进行操作（Elbashir et al.，2001），优化shGhrelin和Lipofectamine 2000的混合比例，分别按1∶2、1∶3和1∶4的比例将shGhrelin转染胃黏膜上皮细胞，同时设正常对照组和阴性对照组。在DMEM/F-12无血清培养基加入质粒DNA，轻轻混匀；用无血清的DMEM/F-12稀释Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温放置5 min；将稀释好的Lipofectamine 2000与质粒DNA混匀，室温放置20 min，形成DNA/Lipofectamine复合物。将复合物加入到含有细胞和培养基的6孔板中，来回轻轻摇晃细胞培养板。在37 ℃、5% CO2培养箱中温育，分别于转染后24、48 h荧光检测转染情况，选择转染效率高且细胞状态良好的转染组提取细胞RNA和总蛋白。

1. 5 实时定量RT-PCR检测Ghrelin基因mRNA表达量

转染结束后，采用Trizol试剂盒提取细胞中总RNA。测定总RNA的浓度和纯度，并以1.4%琼脂糖—甲醛变性凝胶电泳检测总RNA质量。用随机引物对所有样品RNA进行反转录（RT）以获得cDNA，RT反应体系25.0 μL，其中总RNA 2.0 μg，0.4 mmol/L dNTP 1.0 μL，0.4 μmol/L隨机引物2.0 μL，加ddH2O至10.0 μL；70 ℃变性5 min后即刻冰上冷却，加入8 U RNA酶抑制剂、5.0 μL 5×RT Buffer和100 U M-MLV反转录酶，DEPC水补足至25.0 μL；然后37 ℃反应60 min，95 ℃反应5 min。以不加反转录酶的体系作阴性对照（C1），用于检测RNA样品是否存在基因组DNA污染。Ghrelin基因引物序列根据GenBank中猪的相关cDNA序列进行设计，所有引物（表1）由宝生物工程（大连）有限公司合成。

以GAPDH为内标基因，采用荧光定量RT-PCR检测目的基因的表达量，重复3次，2-△△Ct统计分析有效性数据。同时以ddH2O和RNA为模板，检验是否存在外源和基因组DNA污染。

1. 6 H+-K+-ATPase（质子泵）活性测定

转染结束后弃培养液，每孔中加入1.0 mL的0.2% Triton X-100，吹打破碎细胞，收集细胞破碎液，按试剂盒说明进行测定，结果以反应1 h内H+-K+-ATPase磷酸化释放磷量和细胞总蛋白含量比值来表示，单位为μmol/mg·h。

1. 7 统计分析

采用SPSS 11.0进行统计分析，以单因子方差分析（One-way ANOVA）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 胃黏膜上皮细胞的培养及鉴定结果

如图1和图2所示，胰酶消化法可有效分离获得胃黏膜上皮细胞，培养48 h后细胞大量增殖。通过免疫荧光鉴定，发现有大量绿色荧光阳性信号，即确定培养的细胞为仔猪胃黏膜上皮细胞。

2. 2 shGrelin转染条件优化确定

通过优化脂质体与质粒的比例，最终确定质粒（shGhrelin）和脂质体（Lipofectamine 2000）比例为1∶3，以转染后24 h的绿色荧光细胞数量最多（图2）。转染48 h后的荧光细胞数量与转染24 h的相近，无明显变化。

2. 3 shGrelin转染对胃黏膜上皮细胞中Ghrelin基因mRNA表达的影响

与正常对照组相比，阴性对照组胃黏膜上皮细胞中Ghrelin基因mRNA的表达量未发生显著变化（P>0.05，下同），但shGhrelin转染组胃黏膜上皮细胞中Ghrelin基因mRNA的表达显著降低（P<0.05，下同）（图3）。

2. 4 shGrelin转染对胃黏膜上皮细胞中H+-K+-ATPase活性的影响

如图4所示，shGhrelin转染胃黏膜上皮细胞后，细胞中H+-K+-ATPase活性与正常对照组和阴性对照组相比显著下降，而正常对照组与阴性对照组间无显著差异。

3 讨论

目前，随着RNA干扰技术的不断发展，采用基因沉默阐明相关基因的功能作用已成为研究热点，但通过RNA干扰沉默Ghrelin基因表达来研究其对胃酸分泌的调控作用尚无文献报道。本研究结果表明，构建的shGhrelin表达载体能高效阻断胃黏膜上皮细胞中Ghrelin基因的表达，并显著降低胃黏膜上皮细胞中H+-K+-ATPase活性，揭示Ghrelin对胃酸分泌具有重要的促进作用。

已有诸多研究表明，Ghrelin与胃酸分泌具有密切关系。如Masuda等（2000）、Date等（2001）研究发现，Ghrelin通过中枢神经和迷走神经通路可提高胃酸分泌；Sibilia等（2002）研究表明，Ghrelin可抑制胃酸分泌；Dornonville等（2004）研究表明，Ghrelin对胃酸分泌既无促进作用也无抑制作用。可见，Ghrelin是否参与对胃酸分泌的调节，可能与剂量、评价胃酸分泌能力的指标及处理方法等有关。本课题组的前期研究结果表明，仔猪断奶前后Ghrelin基因表达的发育性变化与胃H+-K+-ATPase mRNA表达呈显著正相关，同时揭示外源Ghrelin作用于胃黏膜上皮细胞，可促进黏膜上皮细胞中H+-K+-ATPase活性（Du et al.，2007）；通过肌肉注射重组Ghrelin也可促进仔猪胃酸分泌（Du et al.，2013）。本研究通过构建shGhrelin表达载体抑制Ghrelin基因mRNA表达来观测其对胃H+-K+-ATPase活性的影响，其结果与本课题组的前期研究结果一致。因此，本研究建立的Ghrelin基因阻断胃黏膜上皮细胞模型为进一步研究Ghrelin调节胃酸分泌的机制及其他生物学功能提供了重要的方法和途径。

4 结论

本研究结果表明，采用RNA干扰技术能沉默胃黏膜上皮细胞Ghrelin基因表达和抑制H+-K+-ATPase活性，表明Ghrelin对胃酸分泌具有重要的调节作用。

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（責任编辑 兰宗宝）