农杆菌介导的芦笋遗传转化体系的建立

鹿志伟 侯晓婉 高建明 张燕梅 杨子平 陆军迎 李俊峰 赵艳龙 周文钊 易克贤

摘 要 以芦笋“井岗701”胚状体为试验材料，在构建pCAMBIA3300-35S-hevein-NOS植物表达载体基础上，采用农杆菌介导的转基因方法，探究菌液浓度、AS浓度、侵染时间和共培养时间等4个因素对芦笋转基因效率的影响，以期建立高效的芦笋转基因体系。结果表明：用菌液浓度OD600=0.6，AS终浓度为200 μmol/L的农杆菌菌液进行侵染，侵染10 min后，暗培养4 d的转基因效率最佳，经PCR检测，阳性转化率达21%，获得了转基因幼苗。本实验构建了完整的农杆菌介导的芦笋遗传转化体系。

关键词 芦笋；农杆菌介导；遗传转化体系

中图分类号 S644.6 文献标识码 A

Abstract Embryoids derived from asparagus“Jinggang 701”were chosen as the experimental materials. With construction of plant expression vector-pCAMBIA3300-35S-hevein-NOS， the effects of liquid bacterial concentration， AS concentration， infection time and co-culture time on asparagus transgenic efficiency were explored by the agrobacterium-mediated transgenic method. The high-efficiency transgenic system of asparagus was expected to be established in this study. The result showed that the optimal infection conditions were liquid bacterial concentration OD600=0.6， adding AS up to final concentration of 200 μmol/L， infecting for 10min and culturing under darkness for 4 d， which made the transformation rate up to 21% and got transgenic plant.

Key words Asparagus（Asparagus officinalis L.）；Agrobacterium-mediated；Genetic transformation system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.009

芦笋（Asparagus officinalis L.）属于天门冬属的多年生草本植物，在欧洲、亚洲、澳大利亚以及美洲的分布尤为广泛，中国是芦笋的主要生产国之一[1]。芦笋除了具有重要的食用价值外，还对多种疾病具有良好的治疗效果，如降血糖、抗癌等，享有“蔬菜之王”的美誉[2-4]。当前市场上流行的芦笋品种虽然高产但是均易感病，尤其是茎枯病严重影响着芦笋的产量，高产、抗病芦笋新品种的选育已成为当务之急。新品种选育主要有杂交育种和转基因育种2种方式，杂交育种的随机性、过程繁琐、育种周期长等特征致使新品种培育具有很大的不可控性，短期内难以得到抗病高产的芦笋新品种。而转基因育种则不同，其可以对植株性状进行定向的改变，品种选育周期短、可控性高，日益成为品种选育的首选方式。

Hevein基因又称为橡胶树凝集因子基因，其表达产生的橡胶树凝集因子是一个富含Cys和Gly的小分子单链蛋白质，具有结合几丁质的作用，是乳胶中橡胶粒子凝集的主要影响因素，也是乳胶中黄色物质的主要蛋白质之一[5]。后来从甜菜叶片、小麦等植物种子中也发现了类似的hevein-like蛋白，经研究发现hevein和hevein-like蛋白在植物体内和体外还表现出广谱的抗菌性，对细菌、真菌等病原菌都具有良好的抑菌性能[6-8]。

目前，国内外有关芦笋转基因育种的相关研究较少，在国内尚未有相关报道，而国外仅3人对芦笋转基因有过报道：Hernalsteens等[9]将空的根癌农杆菌转入芦笋茎中，并成功地在转化植株中检测到胭脂碱和农杆菌素碱，证明根癌农杆菌成功地转入了芦笋中。Bytebier等[10]将含有NOS-APHⅡ基因的根癌农杆菌成功转入芦笋中；Limanton-Grevet等[11]将含有uidA和nptⅡ基因农杆菌AGL1成功转入芦笋胚性系中，并对后代进行了遗传分析。虽然研究人员已成功将外源基因转入芦笋植株中，但是转化体系中转化率均较为低下，转化周期长，且均无目的基因转入。笔者在前人研究的基础上，以芦笋胚状体作为外植体，在构建含有35S-hevein-NOS表达元件的pCAMBIA3300植物表达载体基础上，探究菌液浓度、AS浓度、侵染时间和共培养时间等4个因素对农杆菌介导的芦笋转基因效率的影响，以期进一步完善农杆菌介导的芦笋遗传转化体系，提高遗传转化率，并导入目的基因，为后期芦笋转基因抗病高产新品种选育奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物表达载体：pBI121、pCAMBIA3300，均由中国热带农业科学院热带生物技术研究所张树珍实验室惠赠。农杆菌EHA105菌株和Puc57-hevein由本实验室保存。限制性内切酶均为fermentas公司产品，DNA聚合酶和连接酶为NEB公司产品，其它分析纯药品及试剂盒。芦笋“井岗701”购自江西省农业科学院。

1.2 方法

1.2.1 外植体制备 外植体制备方法参照鹿志伟等[12]的研究方法。

1.2.2 植物表达载体构建 设计5′TGCTCTAGAAT

GAAATACTGTACTATGTTTAT3′（添加XbaⅠ酶切位点）和5′CGAGCTCTCAGTTGGCACCGC3′（添加SacⅠ酶切位点）引物对hevein基因进行扩增，随后对扩增得到的目的片段进行电泳检测。准确无误后，对扩增得到的目的基因和pBI121进行XbaⅠ和SacⅠ双酶切，分别使用PCR产物回收试剂盒和胶回收试剂盒对二者进行目的片段回收，将回收得到的目的基因和pBI121大片段进行T4 DNA连接酶连接，获得含hevein基因的pBI121载体（图1）。随后分别对改造后的pBI121载体和pCAMBIA3300进行HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，使用胶回收试剂盒对pBI121进行小片段回收，而对pCAMBIA3300则进行大片段回收，对得到的2个片段进行T4 DNA连接酶连接，从而完成含有35S-hevein-NOS基因表达元件的pCAMBIA3300植物表达载体构建（图2），最后采用冻融法将构建好的植物表达载体转入农杆菌EHA105中，-20 ℃备用。

1.2.3 芦笋胚状体对PPT的抗性实验 将芦笋胚状体切成0.6 cm2大小，添加至含0、5、10、20、40、80 mg/L PPT的转化培养基中，每组实验添加20块外植体，重复3次，培养20 d后，观察芦笋胚状体生长状况并统计死亡率。

1.2.4 预培养 将培养好的芦笋胚状体切成0.6 cm2左右的小块，置于预培养基上，26 ℃光培养2 d。预培养培养基：MS+4%蔗糖+800 mg/L谷氨酰胺+500 mg/L酸水解酪素+0.70 mg/L嘧啶醇+0.10 mg/L NAA+0.50 mg/L kinetin，pH5.8。

1.2.5 转化菌液的制备 取-70 ℃保存含pCAMBI

A3300-35S-Hevein-NOS质粒的转化农杆菌菌液20 μL，置于YEP固体培养基（含Kanamycin 50 mg/L和Rifampicin100 mg/L）中，涂布均匀。静置30 min，28 ℃倒置培养2 d。挑取单菌落接种至含Kanamycin 50 mg/L和Rifampicin 100 mg/L 的YEP液体培养基中，28 ℃、250 r/min震荡培养直至对数期（OD600约为0.55左右），5 500 r/min，-4 ℃离心8 min，收集菌体，液体转化培养基悬浮。

1.2.6 侵染和共培养 使用液体转化培养基将上述菌体OD600值分别调节为0.2、0.4、0.6、0.8。将预培养2d芦笋胚状体置于150 mL无菌锥形瓶中，同时锥形瓶中添加50 mL含转化农杆菌菌体和乙酰丁香酮（浓度分别为0、50、100、200 μmol/L）的液体转化培养基，从而对胚状体进行农杆菌侵染，侵染时间为5、10、20、40 min，26 ℃ 150 r/min振荡。无菌滤纸擦干芦笋胚状体表面液体，转移至固体转化培养基中，26 ℃，暗培养2、4、6、8 d。

1.2.7 脱菌与选择培养 使用200 mg/L Timentin对共培养后的芦笋胚状体进行脱菌10 min，100 r/min轻轻振荡，然后无菌水清洗3次。重复3次。无菌滤纸擦干芦笋胚状体表面液体。最后转移至含Timentin和PPT的固体转化培养基中，26 ℃，光培养，直至原有胚状体表面有新的胚状体生成，上述每组实验添加80块胚状体，重复3次，统计抗性胚状体转化率，抗性胚状体转化率/%=抗性胚状体个数/胚状体处理总个数×100。

1.2.8 分子水平检测 PCR检测是一种非常简单、快速和直接的转基因苗检测方法，本实验用此方法对抗性胚状体进行检测。胚状体经PPT筛选后进行PCR验证以及植株再生。采用OMEGA植物DNA提取试剂盒对抗性胚状体进行DNA提取，并进行PCR检测，统计阳性转化率。

1.2.9 抗性植株再生 将选择培养后新长出的胚状体转移到生苗培养基中，进行苗诱导。

1.3 数据分析

使用SPSS19.0和Excel2007软件对试验数据进行统计分析[13-14]。

2 结果与分析

2.1 植物表达载体构建

2.1.1 pBI121-Hevein载体的构建 对pBI121-hevein植物表达载体进行PCR扩增以及电泳分析，发现有且仅有一条约276 bp目的基因条带，与目的基因hevein相符（图3）。

2.1.2 植物表达载体pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS的构建 对pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS植物表达载体进行双酶切以及电泳分析，发现经双酶切后载体被分为2个片段，其中小片段大小为1 100 bp左右，与目的基因表达元件35S-Hevein-NOS相符（图4）。

2.1.3 植物表达载体pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS转化农杆菌及其验证 对pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS植物表达载体进行菌落PCR验证，发现在PCR目的条带大小为1 100 bp左右，与目的基因表达元件35S-Hevein-NOS相符（图5）。

2.2 芦笋胚状体对PPT抗性的研究

由表1和图6可以看出，随着PPT浓度的增加，芦笋胚状体发生萎缩、变黄直至死亡，死亡率逐渐增加，PPT浓度为20 mg/L时胚状体全部死亡。

2.3 不同农杆菌菌液浓度和侵染时间对芦笋遗传转化的影响

由表2可知，不同菌体浓度对抗性胚状体的转化率存在显著性差异（p<0.05），当菌体浓度为0.6时，转化率最高。由表3可知，不同侵染时间对抗性胚状体的转化率不存在显著性差异（p<0.05），为达到侵染时间最短以及转化率较高的目标，侵染时间选择10 min为佳。因此，农杆菌菌液浓度OD600=0.6，侵染时间10 min时为最佳作用条件。

2.4 不同共培养时间对芦笋遗传转化的影响

由表4可知，当共培养时间为4 d和6 d时，抗性胚状体转化率与其它处理相比差异显著，转化率分别为15.0%和14.0%。为了节省培养时间，同时又使转化率达到最高，共培养时间选择4 d为佳。

2.5 不同浓度AS对芦笋遗传转化的影响

由表5可知，不同AS浓度对抗性胚状体转化率存在显著性差异（p<0.05）。当AS浓度为100、200 μmoL/L时，抗性胚状体转化率与其它处理相比差异显著，转化率分别为16.0%和20.0%。为了使转化率达到最高，AS添加浓度选择200 μmoL/L作为最佳。

2.6 转基因植株的PCR检测

由图7可知，阳性对照和再生芦笋植株PCR结果中目的条带大小一致，约为1 100 bp，大小与基因表达元件35S-Hevein-NOS相符。整个转基因过程见图8。

3 讨论与结论

农杆菌介导的植物遗传转化是一个非常复杂的过程，受外植体类型、菌液浓度、菌株类型、侵染时间、共培养时间、以及乙酰丁香酮浓度等多种因素影响，而且不同植物基因型、外植体其对应的农杆菌最佳侵染条件不同，转化率也具有很大差异。农杆菌作为转化效果最好的植物转化方式之一，目前为止已有很多相关研究，如周月等[15]通过农杆菌介导法将LJAMP2基因成功导入“红阳”泥猴桃中，其使用的最佳农杆菌侵染条件为：共培养时间为2 d，农杆菌菌液浓度为OD600=0.5，侵染时间为10 min，AS浓度为100 μmol/L，转化率达到5.11%；Gnasekaran等[16]农杆菌介导的兰花转基因中，最佳的农杆菌侵染条件为：OD600=0.8，侵染时间30 min，共培养4 d，AS浓度为200 μmol/L，转化率高达33.6%。

农杆菌介导的芦笋遗传转化体系的研究已有部分工作，如Bytebier等[17]使用愈伤组织作为外植体，经过侵染、选择培养以及植株再生等得到了转基因芦笋植株，但是转化周期较长。Bruno等[18]使用C58农杆菌菌株，同时对3个基因型的芦笋体细胞进行转化，检测得到阳性植株，但是转化率较低，为0.6%～4%。Limanton-Grevet等[19]使用AGL1Gin农杆菌菌株，选用5个胚性系作为侵染对象，结果发现转化率为0.8%～12.8%，转化率得到提高。本研究在综合对比分析前人研究的基础上，以芦笋胚状体作为侵染对象，采用EHA105农杆菌菌株，并对菌体浓度、侵染时间、共培养时间等侵染条件进行优化。结果表明，芦笋转化率大大提高，最高可达21%。转化周期得到有效地缩短，遗传效率得到极大地提高。另外，实验中成功将hevein基因和bar基因转入芦笋植株中，有利于后期抗病、抗除草剂芦笋新品种的选育。

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