响应面法优化葫芦多糖提取条件

阿得力江·吾斯曼 买买提·艾孜子 阿依姑丽·买买提明 吐尔洪·努尔 赛福丁·阿不拉

摘要：【目的】采用響应面法优化葫芦多糖提取工艺，为葫芦多糖的深入研究提供参考依据。【方法】以葫芦为原材料，在单因素试验的基础上，以提取温度、水料比及提取时间为自变量，采用响应面法进行3因素3水平的中心组合试验，分析3个因素及其交互作用对多糖提取率的影响，确定最佳提取工艺条件。【结果】二次元回归方程为：Y=

5.54+0.14A+0.43B+0.36C+0.016AB-0.081AC-0.13BC-0.34A2-0.23B2-0.21C2（R2=0.9956；A为提取温度，B为水料比，C为提取时间，Y为葫芦多糖提取率）。葫芦多糖提取率影响因素排序为：水料比>提取时间>提取温度，3个因素及水料比与提取时间的交互作用对多糖提取率影响极显著（P<0.01），提取温度与提取时间的交互作用影响显著（P<0.05）。葫芦多糖最佳提取工艺条件为：提取温度82 ℃、水料比24∶1（mL/g）、提取时间2.3 h、提取次数2次，在此条件下，多糖提取率可达（5.810±0.240）%，与模型预测值5.820%接近。【结论】通过响应面法优化的葫芦多糖提取工艺模型具有可行性，优化后的工艺条件可提高葫芦多糖提取率。

关键词： 葫芦；多糖；响应面法；提取条件优化

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）09-1558-06

Abstract：【Objective】The extraction process of polysaccharides from Lagenaria siceraria（Molina） Standl. were optimized by using response surface methodology， in order to provide technical support for further study of polysaccharides from L. siceraria. 【Method】With L. siceraria as raw materials， based on single factor experiment， the extraction temperature， liquid-solid ratio and extraction time were selected as independent variables. Response surface methodology based on a central composite design with 3 factors and 4 levels was applied to analyze effects of 3 factors and their interactions on extraction rate of polysaccharides， so as to optimize extraction conditions. 【Result】The results showed that， the quadratic multinomial regression equation was established as：Y=5.54+0.14A+0.43B+0.36C+0.016AB-0.081AC-0.13BC-

0.34A2-0.23B2-0.21C2（R2=0.9956； A： extraction temperature； B： liquid-solid ratio； C： extraction time）. The 3 factors affecting extraction rate was in order as follows： liquid-solid ratio>extraction time>extraction temperature. Three factors and interaction between liquid-solid ratio and extraction time had extremely significant effect on extraction rate of polysaccharides（P<0.01）， and the interaction between extraction temperature and extraction time also had significant effect（P<0.05）. The optimum extraction process was as follows： extraction temperature of 83 ℃， liquid-solid ratio ratios of 24∶1（mL/g）， extraction time of 2.3 h， extracting polysaccharides twice. Under optimum condition， the extraction rate of polysaccharides was up to （5.810±0.240）%， which was close to the theoretical value（5.820%）. 【Conclusion】The response surface methodology is workable to optimize extraction process of polysaccharides， the optimized process conditions can improve extraction rate of polysaccharides from L. siceraria.

Key words： Lagenaria siceraria（Molina） Standl.； polysaccharide； response surface methodology； optimization of extraction condition

0 引言

【研究意义】葫芦[Lagenaria siceraria（Molina） Standl.]是新疆及周边地区常见的一种食用植物，也是一种传统中药（Shah et al.，2010；阿不都热依木·卡地尔·阿塔哥，2012）。中医记载葫芦可用于治疗水肿、小便不利、黄疸等症（邱德文等，2007），维吾尔医药学中葫芦常用于清热消炎、解郁除狂、润肠通便、安神催眠等（宋立人和胡烈，2005）。在印度等國家，葫芦是一种常见补品，同时也作为驱虫、强心、降血脂、壮阳、泻药、利尿等药物使用（Rahman，2003；Ahmad et al.，2011）。报道显示，植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、保肝等多种作用（刘姚等，2013）。因此，优化葫芦多糖提取工艺，对其药理作用的进一步研究具有重要意义。【前人研究进展】已有研究表明，葫芦含糖类、黄酮、生物碱、葫芦素、类固醇、皂苷、多酚等多种化合物（Ghosh et al.，2008；Irshad et al.，2010），其中糖类含有甲基-D-半乳糖、2-O-甲基-D-木糖、D-木糖、葡萄糖和果糖等成分（Calabrese et al.，1999；Ghosh et al.，2008），但目前有关葫芦有效成分提取工艺的研究较少。范宏等（2013）采用超声波辅助提取甜葫芦中葫芦素B，在最佳提取工艺条件（料液比1∶10、甲醇体积分数70%、提取时间15 min、超声波功率500 W）下得到葫芦素B提取率0.799%；阿力木江·阿不力孜（2014）采用水提醇沉法提取葫芦多糖，并通过正交试验优化其提取工艺，得到最佳提取工艺条件为：提取温度90 ℃、水料比25∶1、提取时间120 min，在此条件下多糖提取率为5.41%。本课题组前期研究发现，葫芦多糖能提高小鼠血清中IL-2水平，同时降低血清中TGF-β1含量，从而发挥对机体的免疫调节作用（阿力木江·阿不力孜等，2015）。【本研究切入点】目前采用响应面法优化葫芦多糖提取工艺的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】选择提取温度、水料比和提取时间为影响因素，采用响应面法确定葫芦多糖最佳提取工艺，为葫芦多糖的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

葫芦采自新疆喀什地区，干燥后粉碎过60目筛密封备用。主要试剂：重蒸酚（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）、葡萄糖（天津永晟精细化工有限公司）。主要仪器设备：ZN-08小型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）、HH-W420数显三用恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）、TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、ME204E型电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]、TDL-50型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 葫芦多糖提取流程 葫芦→干燥→粉碎过60目筛→95%乙醇回流脱脂→水煮过滤，取上清液→减压浓缩→加无水乙醇至80%醇沉→4 ℃沉淀24 h，取沉淀→干燥的粗多糖。

1. 2. 2 多糖含量测定 采用苯酚—硫酸法测定葫芦多糖含量（陈乃东等，2013）。取300 g干燥葫芦，粉碎过60目筛，用95%无水乙醇回流3次进行脱脂，每次1.5 h，30 ℃烘干备用。取备用的葫芦粉末1.00 g置于150 mL圆底烧瓶中，按照1.2.1步骤进行提取，经4000 r/min离心10 min后收集沉淀，烘干称重并测定吸光值，计算葫芦多糖含量，再根据下式计算提取率：

多糖提取率（%）=多糖提取量/原料干重×100

1. 2. 3 单因素试验 分别以提取次数（1、2、3、4和5次）、提取温度（60、70、80、90和100 ℃）、水料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1（mL/g）]和提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h）为单因素，每个测试组重复4次取平均值，并做显著性分析，考察不同因素对葫芦多糖提取率的影响。

1. 2. 4 响应面试验设计 综合单因素试验所得的结果，提取2次后对葫芦多糖提取率无显著影响，故选择提取温度、水料比、提取时间3个因素，进行3因素3水平的响应面分析，设计因素水平见表1。

1. 3 统计分析

采用SPSS 21.0对单因素试验结果进行处理和分析，Design Expert 8.0.6对响应面试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 提取次数对葫芦多糖提取率的影响 由图1可知，固定提取温度80 ℃、水料比20∶1、提取时间2.0 h的条件下，提取2次的葫芦多糖提取率显著高于提取1次（P<0.05，下同），提取次数超过2次后，多糖提取率基本趋于稳定，无显著变化（P>0.05，下同）。因此，提取次数为2次较合适。

2. 1. 2 提取温度对葫芦多糖提取率的影响 由图2可知，固定水料比20∶1、提取时间2.0 h、提取次数2次的条件下，在提取温度60～80 ℃范围内，葫芦多糖提取率显著升高，80 ℃达最大值，80 ℃后多糖提取率有所下降。因此，提取温度选择80 ℃左右为宜。

2. 1. 3 水料比对葫芦多糖提取率的影响 由图3可知，固定提取温度80 ℃、提取时间2.0 h、提取次数2次的条件下，水料比为10∶1～20∶1时，葫芦多糖提取率快速升高，在20∶1～30∶1范围内提取率趋于平稳。从优化工艺的角度综合考虑，选择水料比在20∶1左右较合适。

2. 1. 4 提取时间对葫芦多糖提取率的影响 由图4可知，固定提取温度80 ℃、水料比20∶1、提取次数2次的条件下，提取时间在0.5～2.0 h范围内，葫芦多糖提取率显著升高，2.0 h后多糖提取率升高相对缓慢，无显著变化。综合考虑，提取时间控制在2.0 h左右为宜。

2. 2 响应面法优化葫芦多糖提取工艺

2. 2. 1 响应面试验结果 利用Design Expert 8.0.6对表2数据进行二次元回归拟合，以提取温度（A）、水料比（B）、提取时间（C）为自变量，得回归方程为：Y=5.54+0.14A+0.43B+0.36C+0.016AB-0.081AC-0.13BC-0.34A2-0.23B2-0.21C2。對回归模型进行分析，结果如表3所示。回归模型P<0.0001，失拟项P=0.2263>0.05（不显著），相关系数R2=0.9956，AdjR2=0.9900，均接近1.0000，且变异系数CV=0.94%，说明该模型拟合度好，适用于实际提取工艺。葫芦多糖的最佳提取工艺为：提取温度81.47 ℃、水料比23.89∶1、提取时间2.28 h、提取次数2次，此条件下预测的提取率为5.820%。

2. 2. 2 响应面图分析 根据响应图等高线形状及3D图中因素的趋势，可判定变量间相互作用是否明显，各因素对葫芦多糖提取率影响的程度，确定各因素的最佳水平范围。如图5所示，随着水料比的增大，多糖提取率不断增加，对于提取温度则有一个阈值在80～85 ℃，超出此阈值，温度升高提取率则降低，水料比对多糖提取率的影响大于提取温度。图6中，随着提取时间的延长，多糖提取率不断增加，提取温度的变化与图5一致，在80～85 ℃有一个阈值，提取时间对多糖提取率的影响大于提取温度。图7中，随着水料比的增大和提取时间的延长，多糖提取率增加。结合图5～图7及表3可知，各因素对葫芦多糖提取率的影响排序为：水料比（B）>提取时间（C）>提取温度（A），3个因素及水料比与提取时间的交互作用对多糖提取率影响极显著（P<0.01，下同），提取温度与提取时间的交互作用影响显著。

2. 2. 3 试验结果验证 为验证响应面法所得结果的可信度，将优化参数修正为：提取温度82 ℃、水料比24∶1、提取时间2.3 h，提取次数2次，在此条件下进行4次平行试验，得到葫芦多糖提取率为（5.810±0.240）%，与预测的提取率5.820%接近，说明以上优化条件可行。

3 讨论

植物多糖的提取方法主要有溶剂提取法、酶提取法、微波提取法、超临界萃取法等。其中溶剂提取法是传统提取方法，该方法提取成本低廉、操作简单、适用于大规模生产；酶提取法是利用一种或多种特定的酶对植物细胞壁进行破解，使内容物完全释放的一种较温和的多糖提取方法（屈小玄等，2015），但该法对酶的要求较高，特定酶在未知情况下难以实现多糖的提取；微波提取法是利用微波在传统提取方法的基础上进行优化（马涛等，2011），该方法提取时间短，但提取过程中可能会破坏多糖结构；超临界萃取法提取时间短、无溶剂残留，但该方法对设备要求高，且由于糖类化合物分子量较大、极性强，以CO2为溶剂的提取率低（黄小葳，2011）。目前国内对葫芦多糖提取工艺的研究鲜有报道。本研究采用响应面法对葫芦多糖的溶剂提取法进行优化，因溶剂提取为常用的传统方法之一，成本低且不需特殊设备，是初步探究提取工艺最常用的方法之一。与正交试验相比，利用响应面法优化葫芦多糖的提取工艺，既能确定各因素间的相互作用，又能通过模型预测值和验证性试验来确保结果的可靠性，达到提高多糖提取率的目的。

本研究确定了各因素对葫芦多糖提取率影响的大小及各因素间的交互作用，各因素影响排序为：水料比>提取时间>提取温度，3个因素及水料比与提取时间的交互作用对多糖提取率的影响极显著，提取温度与提取时间的交互作用影响显著，而提取温度与水料比的交互作用影响不显著。本研究的葫芦多糖最佳提取温度（82 ℃）较阿力木江·阿不力孜（2014）试验所得的提取温度（90 ℃）低，提取时间和水料比基本一致；3个因素中提取温度对多糖提取率的影响最小，且在适当范围内提取温度低，有利于防止因高温引起的多糖活性降低或化学结构改变。在优化条件下通过验证试验得到葫芦多糖提取率为（5.810±0.240）%，与预测的提取率5.820%接近，较阿力木江·阿不力孜（2014）正交试验测得的葫芦多糖提取率（5.41%）略高，说明利用响应面法优化葫芦多糖提取工艺可提高其提取率。

目前对葫芦多糖的研究仍处于初步阶段，葫芦多糖分子量测定、单体的分离及结构鉴定，药理作用如抗炎、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等方面有待进一步研究，本研究通过响应面法优化葫芦多糖的提取工艺可为其相关研究打下基础。

4 结论

通过响应面法优化的葫芦多糖提取工艺模型具有可行性，优化后的工艺条件可提高葫芦多糖提取率。

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（責任编辑 罗 丽）