一株产木聚糖酶菌株的鉴定及产酶条件研究

吴小建 吴圣进 汪茜 韦仕岩 王灿琴

摘要：【目的】对一株从木薯渣堆中分离得到的产木聚糖酶嗜热真菌JG-50菌株进行分类鉴定，并研究其利用木薯渣固态发酵产酶的最佳条件，为该菌株在农业有机废弃物发酵利用中的应用提供理论依据。【方法】采用真菌形态学观察和26S rDNA基因D1/D2区序列同源性分析方法对JG-50菌株进行分类鉴定，并以单因素试验方法对JG-50菌株产木聚糖酶的最佳碳源、氮源、培养时间、培养温度和培养基初始pH等发酵条件进行优化。【结果】菌株JG-50与嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus isolate MTCC 4890）的26S rDNA序列相似性为99%，结合形态学特征初步鉴定为嗜热子囊菌属的一种。该菌株能以木薯渣为碳源固态发酵产木聚糖酶，其产酶的最佳条件为：以木薯渣为碳源，添加60%麦麸，0.3%蛋白胨和0.2%酵母粉，pH 6.0，以此培养基50 ℃培养8 d，木聚糖酶活可达4625.4 U/g（干培养基）。【结论】嗜热真菌JG-50具有较强的产木聚糖酶能力，在农业有机废弃物发酵利用领域具有良好的应用前景。

关键词： 嗜热子囊菌；分类鉴定；木聚糖酶；木薯渣

中图分类号： Q939.96 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）09-1522-06

Abstract：【Objective】A xylanase-producing thermophilic fungi strain JG-50 isolated from cassava residue was classified and identified， and its fermentation conditions for enzyme production was optimized， in order to provide technical support for its application in agricultural organic waste fermentation utilization. 【Method】Strain JG-50 was identified based on morphologic observation and sequence homology analysis of D1/D2 domain of 26S rDNA gene. The fermentation conditions including carbon source， nitrogen source， culture time， culture temperature and initial pH were optimized by single factor test， for producing xylanase by strain JG-50. 【Result】26S rDNA sequences similarity was as high as 99% between strain JG-50 and Thermoascus aurantiacus isolate MTCC 4890. Based on morphological observation and data of 26S rDNA sequences alignment， the strain JG-50 was identified as T. aurantiacus. Strain JG-50 was able to produce xylanase during solid state fermentation using cassava residue as carbon resource， and the optimal fermentation substrate were， 60% of wheat bran， 0.3% of peptone and 0.2% yeast powder， with pH of 6.0. In the above substrate， the enzyme activity of xylanase reached 4625. 4 U/g after fermenting for 8 days at 50 ℃. 【Conclusion】Strain JG-50 has a considerable ability of producing xylanase， and shows good application prospect on fermentation utilization of agricultural organic waste.

Key words： Thermoascus aurantiacus； classification and identification； xylanase； cassava residue

0 引言

【研究意义】半纤维素是农作物秸秆等植物材料的重要组成成分，其含量仅次于纤维素，而木聚糖是植物半纤维素的主要成分。木聚糖酶是一类可以将木聚糖降解成低聚糖和木糖的水解酶，主要包括内切β-1，4-木聚糖酶（β-D-1，4-xylanase， EC 3.2.1.8）、外切β-1，4-木聚糖酶（β-D-1，4-xylanase， EC 3.2.1.92）和β-木糖苷酶（β-1，4-xylosidase， EC 3.2.1.37）。内切β-1，4-木聚糖酶是木聚糖降解酶中最关键的酶，其以内切方式水解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量木糖（Collins et al.，2005）。木聚糖酶对半纤维素物质的降解对于秸秆资源的利用具有重要意义，已被广泛应用于生物转化、食品、饲料、医药、能源和造纸等行业（Collins et al.，2005；包怡红和李雪龙，2006；Nortey et al.， 2007）。但木聚糖酶应用于工业生产中多数需要具备嗜热或嗜碱的特性，至今为止，关于嗜热嗜碱特性的木聚糖酶仅有10余种（柏文琴等，2014），与已经分离到的数百个木聚糖酶资源相比，嗜热嗜碱木聚糖酶的数量非常有限。生产应用酶制剂除了考虑酶活性及表达量外，还需根据不同的应用条件考虑其稳定性（包怡红和李雪龙，2006），因此，分离选育适应能力强和产酶能力高的微生物菌株仍是木聚糖酶生产应用的关键。同时，利用廉价的农业废弃物如秸秆、玉米芯、蔗渣和麸皮等诱导生产木聚糖酶能有效降低酶制剂的生产成本（李秀婷等，2004），也是木聚糖酶生产利用的主要发展方向之一。【前人研究进展】木聚糖酶广泛存在于细菌、霉菌和酵母菌等微生物中（万红贵等，2001），其中霉菌如嗜热棉毛菌、木霉、曲霉和青霉等因产酶能力强而备受关注（宋红霞等，2011）。目前研究较多的是木霉、曲霉和细菌所产生的木聚糖酶，不同来源的木聚糖酶其酶学性质也有所差异（Wong et al.，1988），工业生产中多数需要具备耐热、耐酸碱特性的木聚糖酶，因此，有不少科研工作者从土壤、酸碱等极端环境中筛选产木聚糖酶的菌株，以期获得具有相应特性的木聚糖酶。庞宗文等（2012）从土壤中分离到一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌，其最佳产酶条件为：玉米芯∶麸皮=7∶3（w/w）；最佳氮源為酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量1.5%；吐温-80添加量0.5%，初始pH 7.2，培养基水含量80%，250 mL三角瓶装料量8 g，发酵温度50 ℃，发酵时间72 h；该酶最适温度为75 ℃，最适pH 4.5，在70 ℃以下具有良好的稳定性。单志琼等（2012）从盐碱湖土壤中筛选到25株产碱性木聚糖酶菌株，所产木聚糖酶具有较好的热稳定性和碱稳定性。目前，利用农业废弃物产木聚糖酶的报道较多，常见的麸皮、麦秆、玉米芯、稻秆、稻壳、高粱秆、甘蔗渣等均可诱导生产木聚糖酶（吴萍和姚伍，2006；丛倩千等，2009），利用此类农业废弃物作诱导底物能有效降低生产成本，产生的木聚糖酶也适合于工业应用。【本研究切入点】广西是我国第一大木薯生产省份，木薯生产加工产生大量的木薯渣。目前对木薯渣的再利用主要有制作肥料、饲料，栽培食用菌，制沼气等（刘倩等，2012），利用木薯渣发酵产木聚糖酶的研究报道较少。【拟解决的关键问题】采用真菌经典形态学鉴定结合现代分子生物学鉴定技术，对一株从废弃木薯渣堆中分离获得的产木聚糖酶的嗜热真菌JG-50进行分类鉴定，并进一步采用单因素试验研究其利用木薯渣为碳源生产木聚糖酶的适宜条件，旨在获得能利用木薯渣等农业有机废弃物发酵产木聚糖酶的优良菌株，为该菌株在农业有机废弃物发酵中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试菌株JG-50分离自广西金光农场木薯渣堆积物，保存于广西农业科学院微生物研究所。桦木木聚糖购自Sigma公司，3，5-二硝基水杨酸（DNS）等其他试剂均为国产分析纯。斜面培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL，pH为自然值，在121 ℃下灭菌20 min。液体种子培养基（g/L）：（NH4）2SO4 1.4、MgSO4·7H2O 0.3、KH2PO4 2.0、CaCl2 0.3、FeSO4·7H2O 0.005、MnSO4·H2O 0.0016、ZnSO4·7H2O 0.0014、CoCl2·7H2O 0.002、酵母提取物1.0、蛋白胨3.0、葡萄糖10.0，pH调至6.0，在121 ℃下灭菌20 min。固体发酵培养基：木薯渣，用不含葡萄糖的液体种子培养基调节水含量为60%，在121 ℃下灭菌30 min。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌株培养条件 将目的菌株从斜面接入装有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶，于50 ℃下160 r/min恒温培养3 d，再以2%的接种量将菌种接入固体发酵培养基，于50 ℃恒溫培养7 d。

1. 2. 2 菌株形态鉴定 参考《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）， 通过观察菌落特征，菌丝形态，孢子形态、大小及产孢类型等对菌株进行经典形态学鉴定。

1. 2. 3 菌株26S rDNA鉴定 通过PCR扩增真菌基因组26S D1/D2区，其中正向引物26S-F： 5'-GCATATC

AATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物26S-R： 5'-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。PCR反应体系（100.0 μL）：10×扩增缓冲液10.0 μL，dNTPs（每种2.5 mmol/L）8.0 μL，引物（10 μL/L）各2.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）1.3 μL，无菌超纯水补足至100.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性5 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，进行35个循环；72 ℃延伸8 min。将扩增条带进行胶回收后送至生工生物工程（上海）股分有限公司测序。测序后所得序列提交GenBank进行BLASTn比对，用ClustalX 1.8进行多序列比对分析，利用MEGA 4.0中的Neighbor-Joining法构建系统发育进化树。

1. 2. 4 发酵粗酶液制备与部分纯化 粗酶液制备：取固态发酵好的培养物10 g，加入100 mL蒸馏水，于40 ℃下浸提2 h，过滤，于4 ℃下5000 r/min离心30 min，上清液即为粗酶液。硫酸铵沉淀：取7支试管，各加入10 mL粗酶液，分别加硫酸铵至饱和度30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，于4 ℃过夜后10000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀溶于20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，下同），测酶活和蛋白含量。粗酶纯化：参照硫酸铵沉淀中确定的硫酸铵浓度进行分级沉淀，收集饱和度40%～60%的沉淀，沉淀再用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解并置于相同缓冲液4 ℃透析过夜，冻干备用。

1. 2. 5 酶活性和蛋白测定 DNS液配制和木糖含量测定参照Miller（1959）的方法。酶活性测定参照Bailey等（1992）的方法：取适当稀释的酶液0.5 mL，加入1.5 mL 1%木聚糖溶液，70 ℃恒温水浴，精确反应10 min，立即加入3.0 mL DNS溶液，沸水浴12 min，置于冰上定容至50.0 mL，于490 nm处测吸光值并参照木糖标准曲线求得木糖含量，计算酶活；空白组不经过70 ℃恒温水浴直接加入DNS溶液反应。酶活性单位定义：每分钟产生1 μmol还原糖（以木糖计）所需的酶量为1个酶活性单位，以U/mL（g）表示。

酶活性计算公式：E=nC×1000/MT。式中，E为酶活性（U/mL）；n为稀释倍数；C为木糖含量（g/L）；M为木糖分子量（150）；T为反应时间（min）。

蛋白测定：参照考马斯亮蓝法测定蛋白含量，标准蛋白为牛血清白蛋白（BSA）。

1. 2. 6 发酵产酶条件研究 最佳培养时间的确定：将菌株接入固体发酵培养基中，于50 ℃培养21 d，每2 d取样1次，测定酶活力；初始pH对产酶的影响：将固体发酵培养基的初始pH分别调节为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，接种菌株后50 ℃下培养8 d，测定酶活力；发酵温度对产酶的影响：将菌株接入固体发酵培养基中后，分别在40、45、50、55和60 ℃下培养8 d，测定酶活力；可溶性碳源对产酶的影响：分别以1%蔗糖、乳糖、麦芽糖和可溶性淀粉替代液体种子培养基中的1%葡萄糖，再用这些液体培养基配制固体发酵培养基，接种菌株后在50 ℃下培养8 d，测定酶活性；氮源对产酶的影响：分别以NH4NO3、KNO3、蛋白胨、尿素和牛肉膏替代液体发酵培养基中的（NH4）2SO4，在50 ℃下培养8 d，测定酶活力。

2 结果与分析

2. 1 菌种鉴定

2. 1. 1 形态学特征 JG-50菌株在PDA培养基上培养，30 ℃以下不生长，50 ℃下菌丝生长迅速，培养2 d菌落满皿（直径90 mm），初期菌落正反面均白色，有丛状立起的气生菌丝，高10～16 mm，3 d后菌落表面有白色颗粒状出现，4 d后转为红褐色，粉状，辐射状，圆形，边缘整齐，5～6 d左右产生黄色或棕色的水珠状分泌物，后期菌丝均为匍匐状（图1-a、图1-b、图1-c）。分生孢子梗直立，菌丝无色，壁光滑，粗细不等，直径1.5～12.5 μm（图1-d、图1-e）；分生孢子着生于菌丝末端，0～2个隔膜，颜色较菌丝稍深，球形至纺锤形，壁光滑，窄端平截，长13.0～17.5 μm，宽10.0～15.0 μm。子囊果单生或群生，红棕色，球形或不规则形；子囊易消解，亚球形或椭圆形，长10.0～13.0 μm，宽6.0～8.0 μm，内含8个不规则排列的子囊孢子；子囊孢子透明，长5.0～7.0 μm，宽4.0～5.0 μm（图1-f）。

嗜热子囊菌属（Thermoascus）共包括6个种及变种，其模式菌株T. aurantiacus Miehe由Miehe于1907年从自热干草中分离并描述，本研究分离获得的菌株在形态上与T. aurantiacus相同，因此鉴定为该菌。

2. 1. 2 26S rDNA序列分析结果 菌株的PCR扩增产物电泳结果如图2所示。

菌株JG-50的26S rDNA序列全长为575 bp，比对结果显示菌株JG-50与嗜热子囊菌MTCC 4890菌株有99%的相似性。与GenBank数据库中相关嗜热真菌菌株的26S rDNA序列进行比较，用MEGA 4.0进行分析，按Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，结果如图3所示。JG-50菌株与Dichotomomyces cejpii菌株相距最远，与Byssochlamys verrucosa和Thermoascus aurantiacus isolate MTCC 4890遗传距离最近，但Bysso-

chlamys verrucosa 属耐热真菌，20 ℃下仍可生长，而本研究分离到的JG-50菌株在30 ℃以下不能生长，结合形态学观察结果，判断JG-50菌株为嗜热子囊菌。

2. 2 JG-50菌株产酶条件研究

2. 2. 1 不同培养时间对JG-50菌株产酶的影响 由图4可知，在培养初期，木聚糖酶活性不断上升，至第8 d达150.9 U/g，继续培养至21 d，酶活性始终维持在150.0 U/g左右，综合考虑培养时间与生产成本，最佳产酶培养天数为8 d。

2. 2. 2 初始pH对JG-50菌株产酶的影响 由图5可知，在pH 4～10时JG-50菌株产木聚糖酶活性均维持在较高水平，但以pH 5下生长最快，因此培养基最佳初始pH为5。

2. 2. 3 培养温度对JG-50菌株产酶的影响 由图6可知，培养温度在40～50 ℃时JG-50菌株均维持在较高的产酶水平，但50 ℃下菌丝生长速度最快，故确定该温度为最佳产酶温度。

2. 2. 4 可溶性碳源對JG-50菌株产酶的影响 菌株JG-50在添加不同可溶性碳源的木薯渣基质中培养，以添加纤维二糖的产酶量最高，添加其他碳源与不添加可溶性碳源相比差异不明显（图7）。

2. 2. 5 氮源对JG-50菌株产酶的影响 菌株JG-50在添加不同氮源的木薯渣基质中培养的产酶水平（图8）表明，添加无机氮源无促进产酶作用，而添加有机氮源如麦麸、米糠、黄豆粉和豆粕对产酶均有促进作用，其中麦麸的促进作用最明显。

2. 2. 6 添加不同比例的麦麸对JG-50菌株产酶的影响 不同氮源对JG-50菌株产酶的影响试验结果表明，麦麸的促进作用最明显。通过添加不同比例的麦麸研究其对JG-50产酶能力的影响，结果（图9）显示，随着麦麸添加比例的增加，JG-50的产酶能力也随之上升，至麦麸添加比例为60%时菌株产酶能力达峰值。

3 讨论

木聚糖酶是一类重要的木糖苷键水解酶，在食品和发酵等可再生资源生物转化利用中发挥重要作用（万红贵等，2010；彭静静，2014），但目前商业化木聚糖酶数量不多。Wong等（1988）指出不同来源的木聚糖酶其酶学性质存在差异。李秀婷等（2004）以麦麸和玉米芯粉（8∶2）为复合碳源（99%）， 酵母膏和胰蛋白胨（1∶1）为复合氮源（1%）培养嗜热真菌（Thermomyces lanuginosus CBS288.54-M18）生产木聚糖酶，其活力高达15023 U/g（干基碳源），但其固态发酵培养料以麦麸为主，成本较高。庞宗文等（2012）以从土壤中分离到的嗜热子囊菌为发酵菌株，优化了以玉米芯∶麸皮为碳源的产酶条件，取得了较高的酶活性，同时也分析了以木薯渣作为单一碳源对其酶活性的影响，但未对以木薯渣为碳源的产酶条件进行优化。本研究以从废置木薯渣堆中分离得到的嗜热真菌为发酵菌株，利用木薯渣发酵产木聚糖，在最佳产酶条件下，木聚糖酶活性可达4625.4 U/g（干培养基）。对比李秀婷等（2004）和庞宗文等（2012）的研究结果，发现JG-50菌株的木聚糖酶活性偏低，可能是本研究采用木薯渣为主要碳源导致培养基透气性较差，影响菌株产酶能力。Maciel等（2008）采用甘蔗渣（65%）和豆粕（35%）为培养基固态发酵培养黑曲霉LPB326生产木聚糖酶，培养4 d酶活性达3099.0 U/g（干培养基）；本研究与之相比培养时间较长，需发酵8 d，但酶活性更高。由此可见，本研究在利用木薯渣生产木聚糖酶中具有一定的应用前景，后续研究可进一步考察所产木聚糖酶耐热及耐酸碱性及相关酶学特性，为其实际生产应用提供数据支持和理论依据。

4 结论

嗜热真菌JG-50菌株具有较强的产木聚糖酶能力，在农业有机废弃物发酵利用和食用菌栽培料生产等领域具有很好的应用前景

参考文献：

柏文琴，王钦宏，马延和. 2014. 嗜热和嗜碱木聚糖酶研究进展[J]. 生物工程学报， 30（6）： 828-837.

Bai W Q，Wang Q H，Ma Y H. 2014. Progress in the thermophilic and alkalophilic xylanases[J]. Chinese Journal of Biotechnology，30（6）： 828-837.

包怡红，李雪龙. 2006. 木聚糖酶在食品中的应用及其发展趋势[J].食品与机械， 22（4）： 130-133.

Bao Y H， Li X L. 2006. Application and its developing trendency of xylanase in food[J]. Food and machinery， 22（4）：130-133.

丛倩千，江正强，吕顺意. 2009. 毛壳霉CQ31的鉴定及固体发酵产木聚糖酶条件的优化[J]. 微生物学通报，36（8）：1269-1274.

Cong Q Q， Jiang Z Q， Lü S Y. 2009. Identification of Chaetomium sp. CQ31 and optimization of xylanase production in solid state fermentation[J]. Microbiology China， 36（8）：1269-1274.

李秀婷，杨绍青，江正强，李里特. 2004. 利用农业废弃物生产嗜热真菌（T. lanuginosus）耐热木聚糖酶的固体发酵研究[J]. 工业微生物， 34（4）： 13-18.

Li X T， Yang S Q， Jiang Z Q， Li L T. 2004. Solid state fermentation for producing thermostable endoxylanase by T. lanu-ginosus using agricultural wastes[J]. Industrial Microbiology， 34（4）： 13-18.

刘倩，刘光华，李月仙，严炜，娄予强，郭容琦，张林辉，段春芳. 2012. 木薯废弃物综合利用研究进展[J]. 热带农业科学，32（10）：51-54.

Liu Q， Liu G H， Li Y X， Yan W，Lou Y Q， Guo R Q， Zhang L H， Duan C F. 2012. Research progress on the comprehensive utilization of cassava waste[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture，32（10）：51-54.

庞宗文，郭法谋，徐勇，梁静娟，彭幸，陆薇. 2012. 高产木聚糖酶嗜热子囊菌固体发酵条件與酶学性质[J]. 食品工业科技，（3）：170-173.

Pang Z W， Guo F M， Xu Y， Liang J J， Peng X， Lu W. 2012. Optimization of xylanase production conditions by Thermoascus aurantiacus QS7-2-4 in solid state fermentation and the properties of xylanase[J]. Science and Technology of Food Industry，（3）：170-173.

彭静静. 2014. 利用pHsh载体克隆与表达多功能半纤维素酶[J]. 江苏农业学报，30（4）： 875-879.

Peng J J. 2014. Cloning and expression of multi-functional hemicellulase using pHsh as vector in Escherichia coli[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences， 30（4）： 875-879.

单志琼， 周峻岗， 周宇飞， 袁汉英， 吕红. 2012. 产碱性木聚糖酶菌株的筛选及酶学性质[J]. 遗传，34（3）： 356-365.

Shan Z Q， Zhou J G， Zhou Y F， Yuan H Y， Lü H. 2012. Isolation and characterization of an alkaline xylanasefrom a newly isolated Bacillus sp. QH14[J]. Hereditas， 34（3）： 356-365.

宋红霞，李秀婷，孙宝国，宋焕禄，朱运平. 2011. 微生物利用木质纤维原料产木聚糖酶研究现状[J]. 北京工商大学学报（自然科学版）， 29（2）： 63-69.

Song H X， Li X T， Sun B G， Song H L， Zhu Y P. 2011. Research progress on xylanase production by microbial fermentation on lingo-cellulose[J]. Journal of Beijing Technology and Business University（Natural Science Edition）， 29（2）： 63-69.

万红贵， 武振军， 蔡恒，吴启赐，石楠. 2010. 微生物发酵产木聚糖酶研究进展[J]. 中国生物工程杂志， 30（2）： 141-146.

Wan H G， Wu Z J， Cai H， Wu Q C， Shi N. 2010. Recent progress on the production of xylanase by Microbial Ferm entation[J]. China Biotechnology， 30（2）： 141-146.

魏景超. 1979. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社.

Wei J C. 1979. Fungi Identification Manual[M]. Shanghai：Shanghai Scientific and Technical Publishers.

吴萍， 姚伍. 2006. 白灵菇产木聚糖酶营养条件的优化[J]. 中国农学通报， 22（10）：206-208.

Wu P， Yao W. 2006. Nutritional Conidition Optimization of the xylanase production by Pleurotus nebrodensis[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，22（10）：206-208.

Bailey M J， Biely P， Poutanen K. 1992. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J]. Journal of Biotechnology， 23（3）： 257-270.

Collins T， Gerday C， Feller G. 2005. Xylanases， xylanase fami-

lies and extremophilic xylanases[J]. Fems Microbiology Reviews， 29（1）： 3-23.

Maciel G M， Vandenberghe L P D S， Haminiuk C W I， Fendrich R C， Bianca B E D， Brandalize T Q D S， Pandey A， Soccol C R. 2008. Xylanase production by Aspergillus niger LPB 326 in solid-state fermentation using statistical experimental designs[J]. Food Technology and Biotechnology， 46（2）：183-189.

Miehe H. 1907. Die Selbsterhitzung des Heus： Eine biologische Studie[M]. Jena， Germany：Gustav Fischer Verlag：1-127.Miller G L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for the determination of reducing sugars[J]. Analytical Chemistry， 31（3）： 426-428.

Nortey T N， Patience J F， Sands J S， Zijlstra R T. 2007. Xylanase supplementation improves energy digestibility of wheat by- products in grower pigs[J]. Livestock Science，109（1）： 96-99.

Wong K K， Tan L U， Saddler J N. 1988. Multiplicity of beta-1， 4-xylanase in microorganisms： functions and applications[J]. Microbiological Reviews， 52（3）： 305-17.

（責任编辑 麻小燕）