番茄粉红色果实相关基因的dCAPS和InDel标记开发与应用

董淑芳　王孝宣　高建昌　国艳梅　黄泽军　杜永臣（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）



番茄粉红色果实相关基因的dCAPS和InDel标记开发与应用

董淑芳王孝宣高建昌国艳梅黄泽军杜永臣*
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

摘 要：采用Super BSA方法分别构建100份粉红色番茄材料和100份红色番茄材料的DNA混合池，对测序结果的SNP位点进行分析。结果表明：在1号染色体上的127个SNP位点中，有6个与番茄果实颜色高度相关，其中1个位点与粉红色果实高度相关。利用该SNP位点开发了1个共显性dCAPS标记，在红色、粉红色和杂合F13种基因型之间的多态性较好。同时，利用番茄重测序数据分析番茄起源时发现，在粉红色番茄中SIMYB12基因的上游存在1个603 bp的缺失，利用该缺失突变位点开发了1个共显性InDel标记，在红色、粉红色和杂合F13种基因型之间也表现出较好的多态性。利用新开发的2个标记对F2群体进行遗传分析，鉴定结果与田间表型观察结果符合度均达到95%以上，表明这2个标记可以用于番茄苗期分子标记辅助选择。

关键词：番茄；粉红色果实；dCAPS；InDel；分子标记

董淑芳，女，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：shufangdong04@163.com

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是世界人民喜爱的重要蔬菜作物。据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，2013年全球番茄年产量为163 963 万t。番茄在我国栽培历史虽短，但已经成为主要的蔬菜作物之一，年种植面积已达125.5万hm2（1 882.5万亩），年产量3 010.2万t（董春娟 等，2015）。番茄品种多、用途广、营养丰富，番茄红素有很强的抗氧化功能，具有较高的营养价值和保健作用。随着人民生活水平的提高，消费者对番茄大小、形状、颜色、风味、耐贮运性等不断提出更高的要求，生产上迫切需要品质好、抗性强、产量高的番茄品种（裴华丽 等，2014）。

粉红色番茄受到中国、日本、韩国等亚洲人的喜爱。在中国北方地区粉红色番茄的需求量很大，近年来南方地区对粉红色番茄的需求量也在逐渐提升。因此，高品质粉红色番茄品种的选育已是我国重要的育种目标之一。但由于中国非番茄原产地，番茄种质均直接或间接引自国外，而且多数为红色果实，不太符合中国、日本、韩国等亚洲人的消费习惯，所以在育种中常需要将红色番茄材料转育为粉红色。番茄粉红色果实由隐性基因y控制，采用常规的育种方法需要在F2才能通过表型进行选择。因此，开发与番茄粉红色果实性状紧密连锁的分子标记，可极大地提高苗期选择的效率。

Adato等（2009）克隆了与番茄透明果皮相关的基因SIMYB12，但是根据其公布的分子标记对育种材料进行鉴定的结果与国内多数粉红色番茄材料不符合。因此，中国农业科学院蔬菜花卉研究所鲜食番茄课题组于2013年将100份高代粉红色番茄材料和100份红色番茄材料进行了混合建池，拟采用Super BSA（bulked segregation analysis）方法开发与番茄粉红色果实紧密连锁的分子标记。

最近，本所鲜食番茄课题组在利用番茄重测序数据分析番茄起源时发现，在粉红色番茄中SIMYB12基因的上游71 247～71 250 Mb之间存在1个603 bp的缺失，而红色番茄则不存在缺失现象；另外在部分粉红色番茄中存在两个无义突变，一个突变是替换（在71 255～71 256 Mb之间，由T碱基替换C碱基）；另一个突变是插入（在71 255～71 256 Mb之间，在TG之间插入1个碱基A），这两个突变导致了终止密码子提前出现，可能是引起透明果皮的原因（Lin et al.，2014）。

基于上述研究结果，本试验拟同时利用Super BSA方法和InDel标记方法筛选出与番茄粉红色果实相关的简单适用的分子标记，以提高粉红色番茄材料的选择效率。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试高代纯合粉红色番茄自交系材料100份、红色番茄自交系材料100份、红色番茄亲本材料15g-80、粉红色番茄亲本材料15g-91及其F2，均由本所鲜食番茄课题组提供。

所有试材于2013年播种于本所顺义基地温室中，每份材料种植13株、F2种植200株，均按常规方法种植与管理。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取 番茄幼苗二叶一心时，取2片长约1 cm的新鲜幼嫩叶片，采用改良CTAB法（Fulton et al.，1995）提取DNA。

1.2.2混合池构建 对提取的DNA用1%琼脂糖凝胶进行质量检测，上样量为5 μL，DNA 1 μL，上样缓冲液3 μL，ddH2O 1 μL。达到测序的要求后，将100份粉红色番茄材料的DNA各1 μg混合均匀组成P1混合池，基因型定义为aa；将100份红色番茄材料的DNA各1 μg混合均匀组成R2混合池，基因型定义为ab。用MseⅠ 酶（购自Promega公司）对混合池的DNA进行酶切，酶切体系为：基因组DNA 500 ng，NEB buffer4 1 μL，MseⅠ 酶0.12 μL，加ddH2O补至50 μL。酶切方法为：37 ℃水浴15 h，然后利用QIAGEN试剂盒（购自QIAGEN公司）纯化，用50 μL EB回溶。酶切之后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，收集长度在380～410 bp之间的DNA片段，组成2个SLAF-seq文库。

1.2.3测序 将酶切产生的不同类型的末端进行平端化修复，同时对5′末端进行磷酸化修饰。在5′磷酸化的平端DNA片段3′末端添加1个“A”，以便后续与5′端有1个突出“T”的solexa接头进行互补连接，从而提高接头连接效率，同时阻止solexa接头自连。使不同的DNA片段具有相同的末端序列，从而可以杂交到芯片（flow cell）上，进行扩增、测序。根据前期酶切预测软件的分析结果选择切胶范围，以获得相应的标签数。增大起始模板量，达到上机测序所需量。将前步处理好的样品进行精确定量（Qubit），然后在flow cell表面进行桥式PCR，使DNA片段扩增为单分子DNA簇（此过程在Cluster Station中进行）。单分子DNA簇长好后将flow cell移入Hi-Seq中，进行测序。

1.2.4信息分析 对测序得到的各样品的读长（reads）数据进行评估，通过相似性聚类、基因型纠错后，再定位到基因组上，得到SLAF标签，对SLAF标签进行多态性分析，得到样品间的多态性标记，然后进行关联分析，定位性状相关候选区域。

1.2.5SLAF标签获得 基因组经酶切后变为多个小片段，每个片段相当于1个标记位点，同一位点reads序列通过相似性聚类，形成1个集合；集合中高深度片段即为潜在基因型，低深度片段可能是测序错误，通过纠错策略对低深度片段进行纠正，最终获得具有1个或多个等位基因的SLAF标签。

1.2.6SNP位点分析 根据经典番茄遗传图谱和Adato等（2009）、Ballester等（2010）的研究结果，已知透明果皮基因位于1号染色体上，因此本试验重点对1号染色体上的127个SNP位点进行分析，将每个SNP位点定义为野生型（W）与突变型（M），对野生型与突变型基因型进行分析。如果粉红色番茄材料与红色番茄材料在2种基因型中出现的比例接近1∶1，则该SNP位点在粉红色番茄材料和红色番茄材料之间不具有较好的多态性，不能用于分子标记的开发；如果突变型或野生型基因型只出现在红色番茄材料或粉红色番茄材料中，或者两者的比例很高或很低，则该SNP位点在粉红色番茄材料和红色番茄材料之间有较好的多态性，可以用于分子标记的开发。

1.2.7dCAPS标记开发 对筛选得到的在粉红色番茄材料和红色番茄材料之间表现出多态性的SNP位点，利用DNAMAN软件对目的SNP位点进行EcoRⅠ 内切酶位点分析，利用Primer Premier进行CAPS分子标记设计，在CAPS标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，从而引入1个EcoRⅠ 的酶切位点，理论上由红色番茄基因扩增出来的谱带没有酶切位点，由粉红色番茄基因扩增出来的谱带有1个酶切位点，该标记的上游引物为P-F：5′-GATGAGATTGAGATTGCTAC-3′；下游引物为P-R：5′-TCTCTCCAGTGCTCTGATGGTTTC TGAATT-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.8InDel分子标记开发 本所鲜食番茄课题组在利用番茄重测序数据分析番茄起源时发现，在粉红色番茄中SIMYB12基因的上游71 247～71 250 Mb之间存在1个603 bp的缺失，而红色番茄则不存在缺失现象。利用缺失位点（图1）设计了4个InDel标记，引物序列见表1。

图1　透明果皮基因SIMYB12的结构以及603 bp的缺失位点

表1　4个InDel标记的引物序列

1.2.9PCR扩增 dCAPS标记的PCR反应体系采用的模板是番茄基因组DNA，利用特异性引物进行扩增。PCR反应体系（15 μL）为：Mix 7.5 μL，正反向引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O补齐到15 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s（不同引物的退火温度根据引物合成说明书适当调整，一般为55～60 ℃），72 ℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10 min；最后16 ℃保存。取8 μL PCR扩增产物，用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，用Bio-Rad公司的凝胶成像系统照相。利用EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，酶切体系为：PCR产物15 μL，10×buffer EcoRⅠ 2 μL，EcoRⅠ 酶0.2 μL，加ddH2O补至20 μL。用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，采用凝胶成像系统照相。

InDel标记的PCR扩增程序与dCAPS标记相同，采用3%琼脂糖凝胶电泳检测。

2　结果与分析

2.1SLAF标签分析

对各样品的测序数据进行评估，包括读取长度、数量和GC含量，aa、ab的读取长度均为90 bp，其中aa共读取16 069 195次，ab共读取14 311 858次；粉红色番茄混合池和红色番茄混合池中GC含量分别为41.38%和41.48%（表2）。获得的标签数量为50 062个，整体平均深度达200.94×。根据等位基因数和基因序列之间的差异，对50 062个SLAF标签进行多态性分析，共得到4种类型的SLAF标签，其中SNP共有3 793个，占全部SLAF标签的7.58%；无多态性的SLAF标签45 766个，占全部SLAF标签的91.42%；未知的有91个，占全部SLAF标签的0.18%；重复的有412个，占全部SLAF标签的0.82%（表3）。其中多态性标记为SNP，称为Marker。

表2　红色番茄、粉红色番茄测序数据统计结果

表3　红色番茄、粉红色番茄DNA混合池SLAF统计结果

2.2与番茄粉红色果实相关的SNP位点筛选

根据经典番茄遗传图谱和Adato等（2009）的研究结果已知透明果皮基因位于1号染色体上，因此本试验重点对1号染色体上的127个SNP位点进行分析，发现其中6个SNP位点与目的基因高度相关（表4）：在SNP位点1中，在红色番茄材料中共测出野生型基因型38次，在粉红色番茄材料中没有检测到；在粉红色番茄材料和红色番茄材料中分别测出突变型基因型76次和54次。在SNP位点2中，在红色番茄材料中共测出野生型基因型42次，在粉红色番茄材料中没有检测到；在粉红色番茄材料和红色番茄材料中分别测出突变型基因型98次和61次。在SNP位点3中，在红色番茄材料中共测出野生型基因型50次，在粉红色番茄材料中没有检测到；在粉红色番茄材料和红色番茄材料中分别测出突变型基因型108次和52次。在SNP位点4中，在粉红色番茄材料和红色番茄材料中分别测出野生型基因型41次和44次；在红色番茄材料中共测出突变型基因型23次，在粉红色番茄材料中没有检测到。在SNP位点5中，在粉红色番茄材料和红色番茄材料中分别测出野生型基因型33次和80次；在粉红色番茄材料中共测出突变型基因型40次，在红色番茄材料中没有检测到。在SNP位点6中，在粉红色番茄材料中共检测出野生型基因型179次，在红色番茄材料中没有检测到；在粉红色番茄材料和红色番茄材料中分别测出突变型基因型84次和220次。

经过分析，第6个SNP位点的野生型基因型仅存在于粉红色番茄材料中，突变型基因型主要存在于红色番茄材料中。因此，重点对该SNP位点进行dCAPS分子标记开发。

表4　番茄1号染色体上与果实颜色相关的SNP位点

2.3dCAPS标记的获得

利用DNAMAN软件对第6个SNP位点所在246 bp片段进行EcoRⅠ 的酶切位点分析，通过引物设计引入错配碱基和1个EcoRⅠ 的酶切位点。

由图2可知，利用该标记对粉红色番茄、红色番茄及其F1进行PCR扩增，均获得了长度为270 bp的产物。利用EcoRⅠ 对PCR产物进行酶切，粉红色番茄得到1条180 bp大小的谱带；红色番茄得到1条220 bp的谱带。

图2　dCAPS标记的PCR产物及EcoRⅠ 酶切产物电泳图谱

利用该标记对F2的200株单株进行遗传分析，其鉴定结果与田间表型观察结果符合性较好，符合度达到95%以上。

2.4InDel分子标记的获得

根据透明果皮基因SIMYB12启动子上游的缺失设计了4个InDel分子标记，将其引物（表1）之中的2～3个进行相互组合，对纯合粉红色番茄、纯合红色番茄及杂合F1进行分析。结果表明引物组合fc-F2、fc-R2，FCPF1、FCPR1，FCPM1、FCPM2难以区分父本、母本及杂合基因型；其中，以引物FCPF1、FCPR1构成的InDel标记具有多态性，但不能区分红色番茄亲本及杂合基因型，而且谱带不清晰（图3）。

图3　与粉红色番茄相关基因SIMYB12的Indel标记检测结果

引物组合分析表明（图3），引物组合fc-F2、 FCPM2及fc-R2构成的InDel标记在粉红色番茄中特异扩增出1条450 bp大小的谱带，在红色番茄中特异扩增出1条155 bp大小的谱带，在杂合F1中扩增出2条分子量分别为155 bp和450 bp的谱带；利用该标记对F2的200株单株进行遗传分析，其鉴定结果与田间表型观察结果符合性较好，符合度也达到95%以上。

综合分析dCAPS标记与InDel标记在父本、母本、F1及F2群体之间的多态性，发现这2个标记的遗传鉴定结果与田间观测结果的一致性和符合性均较好，因此本试验开发的dCAPS标记与InDel标记均可以用于粉红色番茄的苗期辅助筛选。

3　结论与讨论

本试验采用Super BSA测序技术获得了1个与粉红色番茄高度相关的SNP位点，并根据该位点开发出1个较为准确的dCAPS标记；同时又根据番茄重测序数据发现的缺失位点筛选获得1个InDel标记。这2个标记的遗传鉴定结果与田间观察结果的符合性较好，符合度均超过95%，均可以用于粉红色番茄的选育。特别是在回交育种中，在需要将高代红色番茄亲本材料转育为粉红色亲本材料而其他农艺性状完全一致时，通过1次杂交、连续5～6次回交和分子标记辅助选择，每世代通过分子标记筛选后只需要种植3～5株，最后再进行1次自交，就可以在2～3 a内完成育种材料的选育，从而节省大量的人力、物力和财力。这2个标记的应用将极大地加速粉红色番茄的育种进程。

参考文献

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裴华丽，杨天慧，杨艳玲，李美芹，吕金浮，刘永光．2014．保护地粉果番茄新品种比较试验．北方园艺，（16）：24-26．

Adato A，Mandel T，Mintz-Oron S，Venger I，Levy D，Yativ M，Domínguez E，Wang Z，de Vos R C，Jetter R，Schreiber L，Heredia A，Rogachev I，Aharoni A．2009．Fruit-surface flavonoid accumulation in tomato is controlled by a SIMYB12-regulated transcriptional network．PLoS Genet，5（12）：e1000777．

Ballester A R，Molthoff J W，Vos de R，Lintel Hekkert B，Orzaez D，Fernández-Moreno J P，Tripodi S，Grandillo S，Martin C，Heldens J，Ykema M，Granell A，Bovy A G．2010．Biochemical and molecular analysis of pink tomatoes：deregulated expression ofthe gene encoding transcription factor SIMYB12 leads to pink tomato fruit color．Plant Physiol，152（1）：71-84．

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Lin T，Zhu G T，Zhang J H，Xu X Y，Yu Q H，Zhang C Z．2014．Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding．Nature Genetics，46（11）：3117．

· 信息 ·

Development and Application of dCAPS and InDel Markers in Pink Tomato Fruitrelated Genes

DONG Shu-fang，WANG Xiao-xuan，GAO Jian-chang，GUO Yan-mei，HUANG Ze-jun，DU Yong-chen*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：Super BSA was performed to screen SNP between 2 mixed DNA pools，which contained 100 pink tomatoes and 100 red tomatoes．SNPs of the tested result were analyzed．The result indicated that 6 SNPs among 127 SNPs on chromosome 1 were highly correlated with the color of tomato fruit，and 1 SNP was closely linked to pink tomato fruit．By this SNP，a polymorphism dCAPS was developed and showed well correlation with red，pink and heterozygous genotypes．It is recently reported that a 603 bp deletion was characterized at the upstream of SIMYB12 gene in pink tomato．Using this deletion，a InDel marker was developed and also showed good polymorphism among red，pink and heterozygous genotypes．These 2 newly developed molecular markers were further used to analyze genetically the F2population．The result was in line with the field observation．Their accordance rate was above 95%，which suggested that these 2 markers can be used for molecular marker assisted selection in tomato breeding．

Key words：Tomato；Pink fruit；dCAPS；InDel；Molecular marker

*通讯作者（

Corresponding author）：杜永臣，研究员，博士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：duyongchen@caas.cn

收稿日期：2015-04-09；接受日期：2015-06-02

基金项目：国家自然科学基金项目（31372070，31171963），农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目