磷酸肌酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

党旭云， 蔚俊星， 景桂霞， 常建华

(1西安医学院第一附属医院麻醉科，西安　710077； 2西安市第四医院麻醉科； 3西安交通大学第一附属医院麻醉科；*通讯作者，E-mail:13958816@qq.com)



磷酸肌酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

党旭云1， 蔚俊星2*， 景桂霞3， 常建华3

(1西安医学院第一附属医院麻醉科，西安710077；2西安市第四医院麻醉科；3西安交通大学第一附属医院麻醉科；*通讯作者，E-mail:13958816@qq.com)

摘要：目的研究磷酸肌酸不同给药方式对于糖尿病心肌缺血再灌注大鼠内皮素(ET-1)和一氧化氮(NO)含量的影响。方法建立糖尿病病程2周鼠和8周鼠模型各60只，两组大鼠分别随机分为四组(n=8)：假手术组(S组)；I/R+生理盐水组(I/R组)；I/R+Pcr单次给药组(单次给药组)；I/R+Pcr多次给药组(多次给药组)。S组：只在左冠脉部位穿线而不结扎；I/R组：结扎前30 min腹腔注射生理盐水；单次给药组：结扎前30 min，按2 g/kg一次性腹腔注射Pcr；多次给药组：按1 g/kg每日一次腹腔注射Pcr，连续5 d，注药30 min后结扎冠脉；各组均缺血30 min，再灌注2 h。再灌注结束后，分别测定大鼠血浆中ET-1和NO的含量。结果同时间内，与S组相比，I/R组中ET-1的含量均增加(P<0.05)，NO的含量均减少(P<0.01)；与I/R组相比，单次给药组中ET-1含量减少(P<0.05)，单次给药组和多次给药组中NO含量均增加(P<0.01)；与多次给药组相比，单次给药组ET-1含量均减少(P<0.05)，NO含量均增加(P<0.01)。8周鼠S组和I/R组分别与2周鼠对应组比较，ET-1含量均增加(P<0.05)，NO含量均明显减少(P<0.01)。结论磷酸肌酸可减少糖尿病大鼠I/R后血浆ET-1的含量，增加NO的含量，单次大剂量给药效果优于多次小剂量给药。

关键词：磷酸肌酸；糖尿病；缺血再灌注损伤；心肌；内皮素；一氧化氮；大鼠

糖尿病日渐成为危害人类健康的头号杀手，根据最新流行病学调查，中国可能已成为糖尿病患病人数最多的国家，约有9 240万成年人患有糖尿病[1]。糖尿病作为缺血性心脏病的独立发生因素，能够显著增加心血管疾病的发病率和病死率[2]，约80%的糖尿病病人死于心血管疾病。研究表明糖尿病发病机制和内皮细胞功能紊乱相关[3]。而缺血再灌注过程同样伴随有内皮细胞的受损，导致其合成和释放血管舒缩因子功能障碍，反过来又加重再灌注损伤，造成恶性循环。面对糖尿病心肌的缺血缺氧性损害，邓小强等[4]研究表明磷酸肌酸钠预先给药可减轻2型糖尿病患者心肌缺血再灌注损伤，改善预后。但具体机制尚未阐明，本文旨在从内皮细胞功能着手，进一步探讨其保护机制，并研究其保护作用和剂量的关系。

1材料与方法

1.1主要试剂

链脲佐菌素(美国Sigma 公司)；注射用磷酸肌酸钠(海南奇力制药)；一氧化氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)；内皮素放射免疫法试剂盒(北京华英生物技术研究所)。

1.2糖尿病模型的建立

采用健康雄性SD大鼠120只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，体重约180-220 g，用来制作糖尿病模型，以高脂饲料喂养4周后禁食12 h，单次腹腔注射由枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液溶解的链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg，继续高脂饲料喂养72 h,选择体重280-350 g，采尾血测非空腹血糖，血糖持续≥16.7 mmol/L达1周者定为成模糖尿病大鼠。成模大鼠每2周复测一次血糖，血糖<16.7 mmol/L者剔除。分别建立糖尿病病程2周模型和8周模型。

1.3心肌缺血再灌注模型的建立

成模或正常组大鼠称重后，采用乌拉坦腹腔注射麻醉，仰卧位固定于实验台，连接生物机能实验系统，记录心电图。置入自制气管导管，连接动物呼吸机，潮气量5 ml/100 g，频率60-80次/min，吸呼比2 ∶1。胸骨左侧三、四肋间切口，钝性分离至肋间隙，剪断肋骨暴露胸腔，破心包膜，使心脏充分暴露，在左心耳和肺动脉圆锥间找到与左冠状动脉伴行的冠状静脉一并进行结扎，结扎前放置橡皮条。以同步心电图QRS增高、增宽，ST段抬高为结扎成功标志。于结扎成功30 min，剪断结扎线，取出橡皮条，再灌注2 h。

1.4动物分组

糖尿病病程2周鼠和8周鼠分别随机分为4组(n=8):假手术组(S组)；I/R+生理盐水组(I/R组)；I/R+Pcr单次给药组(单次给药组)；I/R+Pcr多次给药组(多次给药组)。每组具体操作如下:S组只在左冠脉部位穿线而不进行结扎，不产生缺血再灌注；I/R组结扎前30 min按20 ml/kg腹腔注射生理盐水，缺血30 min，再灌注2 h；单次给药组结扎前30 min，按2 g/kg一次性腹腔注射Pcr，缺血30 min，再灌注2 h；多次给药组按1 g/kg每日一次腹腔注射Pcr，连续5 d，最后一次注药30 min后结扎冠脉，缺血30 min，再灌注2 h。

1.5内皮素和NO测定

实验结束后自颈内静脉采血约3 ml，用EDTA作为抗凝剂混匀，迅速于3 000 r/min离心15 min，将上清置于-70 ℃保存。用ELISA法测定血浆中ET-1的含量，硝酸还原酶法测定血浆中NO的含量，分别采用北京华英生物技术研究所和南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，操作步骤均按照试剂盒说明书进行。

1.6统计学分析

2结果

2.1模型评价

糖尿病大鼠在高脂饲料喂养的4周内，精神活跃,体重增加明显，外观肥胖，注射STZ后，逐渐表现为精神倦怠，但进食量明显增加，且出现多饮多尿症状。2周时大鼠体重增幅下降，有的甚至体重减轻。8周时大鼠精神不振，食量减少，多饮多尿症状加重，毛皮灰暗，体型消瘦，体重明显降低。造模期间出现了不明原因死亡的共12只，其余监测血糖达标的共有98只，造模成功率为81.7%。心肌缺血再灌注期间，8只死于心力衰竭，3只死于大出血，2只死于呼吸衰竭。实验死亡大鼠均被剔除，并补做相应数量的动物以保证足够的样本数。心肌缺血再灌注模型成功的标准：结扎LAD后，心电图的典型改变，ST段抬高，T波高耸(见图1)。

2.2血浆ET-1测定结果

与S组相比，2周和8周鼠I/R组ET-1含量增加(P<0.05或P<0.01)；与I/R组相比，单次给药组含量降低(P<0.05)，单词给药组较多次给药组ET-1含量明显减少(P<0.01)。8周鼠S组和I/R组分别与2周鼠对应组比较，ET-1含量均增加(P<0.05，见表1)。

2.3血浆NO测定结果

与S组相比，2周和8周鼠I/R组NO含量均明显减少(P<0.01)；与I/R组相比，单次给药组和多次给药组NO含量均明显增加(P<0.01)；单次给药组较多次给药组NO含量明显增加(P<0.01)。8周鼠S组和I/R组分别与2周鼠对应组比较，NO含量均明显减少(P<0.01，见表2)。

图1　结扎LAD后心肌缺血再灌注模型心电图Figure 1　ECG of myocardial ischemia and reperfusion model rats after ligation of the LAD

组别 2周8周 S组80.85±10.1591.31±13.33▲I/R组90.89±12.24△103.66±12.06△△▲单次给药组114.64±14.29△△100.81±10.75*多次给药组124.73±14.35**#123.49±11.24##

同时间与S组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与I/R组比较，*P<0.05，**P<0.01；与单次给药组比较，#P<0.05，##P<0.01；同组与2周比较，▲P<0.05

组别 2周8周 S组86.04±9.4776.87±8.34▲▲I/R组64.41±7.51△△55.46±6.27△△▲▲单次给药组80.03±8.76△△**63.44±7.10△△**多次给药组71.87±7.75**##57.41±6.68##

同时间与S组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与I/R组比较，*P<0.05，**P<0.01；与单次给药组比较，#P<0.05，##P<0.01；同组与2周比较，▲▲P<0.01

3讨论

心脏是一个高耗能的器官，正常情况下，心肌所需能量的60%以上来源于脂肪酸氧化，心肌缺血时，葡萄糖成为主要能量底物，心肌通过无氧酵解来获取能量[5]。而糖尿病机体由于代谢异常，产能障碍，使得心肌细胞内ATP缺乏。同时，由于胰岛素抵抗和长期高血糖的暴露，使得内皮细胞功能受损，从而减少NO的产生及其生物活性，导致血管功能障碍，影响心肌能量供应。内皮素作为内皮细胞释放的强烈的缩血管物质，包括3种异构肽，其中ET-1生物活性最强，对心血管起主要作用。正常情况下，血管内皮合成和释放一定量的NO和ET-1，调节血管张力和通透性及抗凝作用来维持营养物质和氧供应到相应组织[3]。而缺血缺氧和缺血再灌注可减少NO释放而增加ET释放；两者的平衡被打破。ET大量释放可使冠脉血管强烈收缩，除了心肌细胞膜ET受体上调，还因为冠脉对ET的敏感性增加，终可导致心肌的无复流。缺血期，缺血缺氧可直接或间接促进内皮素mRNA的表达，增加ET释放；再灌注期，缺血区心肌无复流，促进氧自由基大量产生，ET进一步释放，形成恶性循环，加重I/R损伤。在糖尿病机体，大量氧自由基还可作用于线粒体膜,使膜通透性改变而导致线粒体结构和功能损伤，产能障碍。

到目前为止糖尿病心脏对I/R的耐受性还没有统一的结论。有研究证实糖尿病心脏对缺血再灌注损伤的抵抗力增加[6]；而另有研究表明自发型2型糖尿病大鼠心肌I/R损伤比非糖尿病对照组重[7]，还有实验则证实:早期(2周)糖尿病的心脏对I/R损伤有耐受性,而对超过8周的糖尿病心脏会造成更大的损伤[8]。本研究结果显示，糖尿病8周病程鼠与2周病程鼠相比，ET-1含量增加(P<0.05)，NO含量减少(P<0.01)，可见糖尿病8周鼠对MIRI耐受性更差。这可能是胰岛素抵抗、能量代谢改变、氧化应激和全身炎症反应增强、离子通道功能障碍共同作用的结果[9]。

磷酸肌酸作为一种高能磷酸化合物，在缺血前30 min对心肌做预处理，可为心肌细胞补充能量，从而维持细胞内ATP浓度的恒定，还可以作为能量从产生部位到消耗部位转移的载体，通过磷酸肌酸穿梭来实现细胞内能量的传递。已经证实磷酸肌酸进入体内后主要分布于心肌和骨骼肌，并能迅速透过细胞膜，而且它在细胞内的扩散系数比ATP和ADP都大,这就为建立细胞内正常的能量代谢反应链创造了可能。其次，磷酸肌酸还可维持线粒体膜结构的完整性及正常的氧化磷酸化功能，改善心肌细胞能量代谢。

本研究结果表明，糖尿病大鼠在经历过I/R后，血浆ET-1含量增加(P<0.05)，NO含量减少(P<0.05)，磷酸肌酸预处理，可使ET-1含量减少(P<0.05)，NO含量增加(P<0.05)，而且单次大剂量给药效果优于多次小剂量给药(P<0.05)。综上所述，磷酸肌酸对糖尿病缺血心肌的保护作用，除了其增加外源性ATP，改善心肌能量供应之外，还可能与减轻内皮细胞损害，调节血管舒缩因子NO和ET-1的平衡有关。

参考文献：

[1]Yang W,Lu J,Neng J，etal.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med,2010,362(12):1090-1101.

[2]Chen QL,Gu EW,Zhang L,etal.Diabetes mellitus abrogates the cardio protection of sufentanil against ischemia/reperfusion injury by altering glycogen synthase kinase-3β[J].Acta Anaesthesiol Scand,2013,57(2):236-242.

[3]肖瑶,吴基良.糖尿病引发内皮细胞功能紊乱的研究进展[J].湖北科技学院学报(医学版),2015,29(2):177-179.

[4]邓小强,陈珂,姜徽，等.磷酸肌酸钠预先给药对2型糖尿病患者心肌缺血-再灌注损伤的影响[J].临床麻醉学杂志,2015,31(1):9-11.

[5]吴财能,屠伟峰,马武华，等.舒芬太尼预处理对烫伤糖尿病和非糖尿病大鼠心肌损伤的影响[J].临床麻醉学杂志,2014,30(7):701-704.

[6]Tani M,Neely JR.Hearts from diabetic rats are more resistant toinvitroischemia: possible role of altered Ca2+metablism[J].Circ Res,1988,62:931-940.

[7]宋荟芬,李虹伟.2型糖尿病患者无症状性心肌缺血的发病机制及筛查研究[J].中国心血管杂志,2011,16(1):15-36.

[8]Aasum E,Hafstad AD,Severson DL,etal.Age-dependent changes in metabolism contractile function and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice[J].Diabetes,2003,52(2):434-441.

[9]何志鹏,孙维福,王松,等.糖尿病心肌缺血/再灌注损伤机制及治疗进展[J].医学综述,2013,19(5):906-909.

Effects of phosphocreatine(Pcr) on the diabetic rats undergoing myocardial ischemia-reperfusion injury

DANG Xuyun1,YU Junxing2*, JING Guixia3, CHANG Jianhua3

(1DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China;2DepartmentofAnesthesiology,ForthHospitalofXi’an;3DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:13958816@qq.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of different administration ways of phosphocreatine(Pcr) on endothelin-1 and NO in diabetic rats with myocardial ischemia-reperfusion injury(I/R).MethodsThe rats were fed with high lipid to establish the diabetic models:2-week disease course and 8-week disease course. The two kinds of rats were respectively randomized into four groups(n=8): sham group, I/R group, single administration of Pcr group, and multiple administration of Pcr group. The artery of rats was not ligated in sham group. The rats in I/R group were given saline 30 min before ligation. The rats were administered with 2 g/kg Pcr once in single Pcr group. The rats were given 1 g/kg Pcr once a day for 5 d in multiple Pcr group. The coronary artery was ligated to induce the myocardial ischemia reperfusion in all rats. The artery was occluded for 30 min by tightening the ligature and followed by reperfusion for 2 h. ET-1 and NO were determined after the reperfusion.ResultsCompared with sham group, the serum level of ET-1 was significantly increased at week 2 and 8 in I/R group(P<0.05)，while the content of NO was significantly decreased(P<0.01). Compared with I/R group, the serum level of ET-1 in single Pcr group was decreased(P<0.05), while the contents of NO in single Pcr group and multiple Pcr group were significantly increased(P<0.01).Compared with multiple Pcr group,ET-1 was decreased in single Pcr group(P<0.05), while NO was significantly increased(P<0.01). In sham group and I/R group, the contents of ET-1 were higher in model rats at 8 week than those at 2 week(P<0.05),while the contents of NO were significantly lower(P<0.01). ConclusionPhosphocreatine could reduce the serum level of ET-1 and increase the content of NO in diabetic rats, which may be one of the mechanisms of myocardial protection. And the effect of single administration and high dose of Pcr is better than that of multiple administration and small dose.

Key words:phosphocreatine;diabetes;ischemia-reperfusion injury;myocardium；endothelin;NO;rats

[收稿日期：2015-07-14]

作者简介：党旭云，女，1984-01生，硕士，主治医师，E-mail：117636555@qq.com.

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)02-0107-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.02.001