HPLC法同时测定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素的含量

王志轩，刘喜纲，崔小丽，郑晓英，刘翠哲*

(1．河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，承德 067000； 2.承德市食品药品检验检测中心， 承德 067000)

HPLC法同时测定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素的含量

王志轩1，2，刘喜纲1，崔小丽2，郑晓英2，刘翠哲1*

(1．河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，承德 067000； 2.承德市食品药品检验检测中心， 承德 067000)

目的：建立高效液相色谱法同时测定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素含量的方法。方法：采用Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；甲醇-乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长356 nm。 结果：金丝桃苷、槲皮素、山柰素分别在4.85～194.25、5.05～202.07和4.90～196.27 μg/ml范围内线性关系良好；平均加样回收率分别为97.34%、96.79%和97.56%，RSD 分别为1.60%、1.01%和1.40%。结论：建立的方法简便、准确、重复性好，可用于照山白药材的质量控制。

照山白，金丝桃苷，槲皮素，山柰素，HPLC

照山白别名万斤、万经棵，为双子叶植物杜鹃花科植物小花杜鹃(RhododendronmicranthumTurcz)的枝叶或花，具有止咳化痰、祛风通络、调经止痛等功效，可用于治疗急慢性气管炎、哮喘、痛经、产后周身疼痛等病症[1-3]。照山白的主要成分为酚酸类化合物[4]、三萜类化合物[5，6]以及黄酮类化合物[7-9]，其中金丝桃苷、槲皮素、山柰素等黄酮类化合物含量较高。近年研究表明，金丝桃苷、槲皮素和山柰素具有抗病毒、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和抗癌等多种药效[10-12]。

照山白中黄酮类成分的含量测定方法有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等[13]。已有文献报道用HPLC测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的含量[14]，以及用 HPLC测定宣木瓜中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量[15]，但未有文献报道同时测定照山白中金丝桃苷、槲皮素、山柰素的含量。本实验应用HPLC法同时测定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素3种成分的含量，为照山白药材的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪；电子分析天平(METTLER TOLEDO XPE26DR)。

1.2 试药 对照品：金丝桃苷(批号111521-201205，含量93.3%)、槲皮素(批号100081-200907，含量96.5%)、山柰素(批号110861-201310，含量93.2%)，均购自中国食品药品检定研究院；照山白药材分别采集于吉林省通化、河北省滦平、宽城，经河北省食品药品检定研究院段吉平研究员鉴定为杜鹃花科植物小花杜鹃(照山白)；乙腈(Fisher Scientific，美国)；甲醇(分析纯，天津市康科德科技有限公司)；磷酸(分析纯，天津佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱采用Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：[甲醇-乙腈(13∶11)]为A，0.1%磷酸为B，梯度洗脱(0～40 min, 25%A；40～60 min, 38%A；60～80 min, 43%A)，流速1.0 ml/min，检测波长356 nm，柱温30 ℃，进样量10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取金丝桃苷对照品10.50 mg、槲皮素对照品10.47 mg、山柰素对照品10.53 mg，置50 ml量瓶中，加一定量的甲醇溶解，定容，摇匀，配制成金丝桃苷浓度为195.93 μg/ml、槲皮素浓度为202.07 μg/ml和山柰素浓度为196.27 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取粉碎后的照山白粉末约1 g，置于锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，称定质量，超声处理30 min，用70%甲醇补足重量，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

2.3 系统适应性试验 分别取供试品溶液和混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果见图1，表明在此色谱条件，金丝桃苷、槲皮素和山柰素3种成分分离良好。

2.4 线性关系考查 分别精密吸取混合对照品溶液0.25、0.5、2.5、5.0、7.5和10.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到3种成分的系列浓度的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，分别以3种对照品的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，作图，得到金丝桃苷、槲皮素和山柰素的回归方程为：金丝桃苷Y=12 1110 715.40X-10 550 469.80(r=0.999 1，n=6);槲皮素Y=12 1110 715.40X-10 558 469.80(r=0.998 7，n=6);山柰素Y=238 205 793.70X-20 836 336.90(r=0.998 6，n=6)。结果表明，金丝桃苷、槲皮素和山柰素分别在4.85～194.25、5.05～202.07和4.90～196.27 μg/ml范围内线性关系良好。

1.金丝桃苷 2.槲皮素 3.山柰素

图1 混合对照品(A)供试品(B)HPLC色谱图

2.5 精密度试验 精密吸取3种成分的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，计算金丝桃苷、槲皮素和山柰素峰面积RSD分别为1.1%、0.14%和0.88%。表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验 分别精密称取粉碎后的同一样品6份，每份1 g，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下方法测定，测得样品中金丝桃苷、槲皮素和山柰素的平均含量分别为5.10、0.10和0.40 mg/g，RSD分别为0.71%、0.56%和1.5%，表明重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一样品溶液10 μl，分别于0、2、6、12、24和48 h进样，结果样品中3种成分金丝桃苷、槲皮素和山柰素峰面积的RSD分别为0.51%、1.5%和1.7%。表明金丝桃苷、槲皮素和山柰素在48 h内稳定。

2.8 回收率试验 分别精密称取9份已知含量样品,每份约0.5 g，分别加入一定量的金丝桃苷、槲皮素和山柰素对照品，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件检测，计算金丝桃苷、槲皮素和山柰素的回收率，结果金丝桃苷平均回收率为97.34%，RSD为1.60%；槲皮素平均回收率为96.79%，RSD为1.01%；山柰素平均回收率为97.56%，RSD为1.40%。见表1-3。

表1 金丝桃苷回收率试验结果

表2 槲皮素回收率试验结果

表3 山柰素回收率试验结果

2.9 含量测定 分别取不同批号照山白药材5份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，外标法计算，结果见表4。

表4 样品测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择 照山白中化学成分较复杂，检测组分较多，实验中曾选择过不同比例的甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、[甲醇-乙腈(1∶1)]-0.1%磷酸、[甲醇-乙腈(13∶11)]-0.1%磷酸等流动相，其中以[甲醇-乙腈(13∶11)]-0.1%磷酸分离效果最为良好，故选择该流动相体系。

3.2 提取方法的选择 在供试品制备时分别考查了甲醇回流提取、乙醇回流提取、索氏提取器提取、超声提取等不同方法，发现超声提取即可提取完全；又对不同浓度的甲醇进行考查，结果发现70%甲醇提取完全，同时对超声处理的时间进行了考查，发现超声处理30 min即可提取完全。

3.3 产地和采收季节的影响 从结果来看，不同产地、不同采收季节对金丝桃苷、槲皮素和山柰素的含量均有影响。从产地来看，吉林产照山白中槲皮素含量最高，采收自滦平的照山白中山柰素含量最高。从采收季节来看，承德地区5月份采收的照山白中金丝桃苷、山柰素均高于7月、10月采收，槲皮素含量也较高，为照山白比较适合的采收季节。

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2015-10-29

河北省高校重点学科建设项目(No.冀教高[2003]4号)

R917

A

1006-5687(2016)01-0015-03

*通讯作者: 刘翠哲，E-mail: liucuizhexy@163.com。