HPLC法测定丹参胶囊中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量

周 军，张 茉，王 杰

(天津市药品检验所，天津 300070)

药品质量与检验

HPLC法测定丹参胶囊中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量

周 军，张 茉，王 杰

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：建立HPLC法测定丹参胶囊中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量。方法：采用waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈为流动相(A)- 0.1%三氟乙酸水溶液为流动相(B)进行梯度洗脱，流速0.8 ml/min，柱温为25 ℃，检测波长为286 nm。结果：丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的线性范围分别为0.010 827～1.082 7 μg、0.000 424 6～0.042 46 μg、0.006 755～0.675 5 μg和0.109 76～3.292 8 μg；丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B平均回收率分别为102.65%、101.21%、101.13%和102.96%，RSD分别为0.63%、1.56%、0.87%和0.70%。结论：所建立的HPLC法可准确测定丹参胶囊丸中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量。

丹参胶囊，丹参素，原儿茶醛，迷迭香酸，丹酚酸B，高效液相色谱法，含量测定

丹参胶囊是由丹参药材制成的中药制剂，具有活血化瘀、镇静安神的功效，用于冠心病引起的心绞痛、心神不宁。其质量标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ04032009，原标准中含量测定项下仅测定丹参酮ⅡA。丹参酚酸类成分是丹参中活血化瘀的有效成分，为了有效控制药品的质量，现采用HPLC法测定制剂中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的含量。修订后的质量标准提高了药品的质量控制指标。

1 仪器与试药

岛津LC-20AD高效液相色谱仪，配有LC-20AD 泵、SIL-20自动进样器、SPD-20A紫外检测器、CTO-20AC柱温箱；LC-solution 色谱工作站。丹参素对照品(批号110855-200809，供含量测定用)、原儿茶醛对照品(批号110810-2010007，供含量测定用，纯度98.2%)、迷迭香酸对照品(批号111871-201102，供含量测定用，纯度99.8%)、丹酚酸B对照品(批号111562-201110，供含量测定用，纯度98.0%)，均于中国食品药品检定研究院购置。丹参胶囊(海南赛立克药业有限公司，批号110904、120306、120905)。甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，乙腈(色谱纯，默克公司)，三氟乙酸(分析纯，默克公司)，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%三氟乙酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～7 min，2% A→10% A；7～20 min，10% A→23% A；20～35 min，23% A→27% A；35～45 min，27% A→49% A；45～46 min，49% A→2% A；46～56 min，2% A)；柱温：25 ℃；流速：0.8 ml/min；检测波长：286 nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于10 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml中分别含22、0.85、14和220 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取同一批号(120905)样品10粒，倾出内容物，研细，取0.1 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心5 min(3 000 r/min)，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，进样，测定，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方取除丹参的辅料，按【制法】制得阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。分别精密吸取对照品、供试品和阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。见图1。

1.丹参素 2.原儿茶醛 3.迷迭香酸 4.丹酚酸B

2.3 标准曲线的制备 取丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B对照品各适量，精密称定，分别加甲醇制成单一成分的对照品溶液，其中丹参素浓度分别为2.165 4、4.330 8、21.654 0、43.308 0、64.962 0和216.540 μg/ml；原儿茶醛浓度分别为0.008 492、0.169 84、0.849 2、1.698 4、2.547 6和8.492 μg/ml；迷迭香酸浓度分别为1.351、2.702、13.51、27.02、40.53和135.10 μg/ml；丹酚酸B浓度分别为21.952、43.904、87.808、219.52、439.04和658.56 μg/ml。分别精密吸取上述对照品溶液各5 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析，分别测定各自峰面积，以相应对照品进样的量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程，见表1。

表1 回归方程与线性范围

2.4 精密度试验 取同一批号样品(120905)适量，研细，取约0.1 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B峰面积，样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B峰面积平均值分别为86 533、24 007、226 771和2 071 089，RSD分别为1.79%、1.86%、1.85%和1.82%，均符合要求。

2.5 重现性试验 取同一批号样品(120905)适量，研细，取约0.1 g，精密称定，共6份，分别精密加入甲醇25 ml，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析，样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B含量平均值分别为5.572 3、0.212 8、3.727 6和59.010 8 mg/g，RSD分别为0.28%、1.14%、0.34%和0.28%，均符合要求。

2.6 稳定性试验 取同一批号样品(120905)适量，研细，取约0.1 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、18和24 h进样，测定，样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B峰面积平均值分别为86 886、23 768、226 771和2 068 765，RSD分别为1.84%、3.62%、1.65%和1.75%；4种成分中，原儿茶醛稳定性测定结果RSD为3.62%，超出2%的规定，其他均符合要求。因此本品提取后，应尽快进行分析测定。

2.7 回收率试验 取同一批号样品(120905)适量，研细，取约0.05 g，精密称定，共6份，分别精密加入丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B浓度为10.827 0、0.424 6、6.756 5和107.163 0 μg/ml的甲醇混合对照品溶液25 ml，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析。计算回收率，结果丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B平均回收率分别为102.65%、101.21%、101.13%和102.96%，RSD分别为0.63%、1.56%、0.87%和0.70%，结果均符合规定。见表2-表5。

表2 丹参素回收率试验结果

表3 原儿茶醛回收率试验结果

表4 迷迭香酸回收率试验结果

表5 丹酚酸B回收率试验结果

2.8 样品测定 取同一厂家3个不同批号的样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析测定，计算样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B含量。结果见表6。

表6 样品含量测定结果 mg/粒

3 讨论

3.1 提取溶剂及提取方法的选择 分别采用水、乙醇、甲醇、50%甲醇及70%甲醇为提取溶剂，经比较加热回流、超声提取两种方法及不同的提取时间，结果以采用甲醇为提取溶剂，超声提取30 min，样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B含量最高。

3.2 流动相的选择 分别采用乙腈-磷酸、乙腈-甲酸等[1-3]进行试验。结果，供试品色谱中相关色谱峰与其他杂质峰分离度均不符合规定，后采用乙腈(A)和0.1%三氟乙酸(B)为流动相进行梯度洗脱，分离效果较好。

3.3 不同色谱柱的比较 不同厂家生产的色谱柱(waters、资生堂、迪马)采用正文中的流动相进行梯度洗脱，样品分离效果均较好。

3.4 稳定性试验 样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B 4种成分24 h稳定性测定结果显示原儿茶醛RSD为3.62%，超出2%的规定，其他均符合要求；因此本品提取后，应尽快进行分析测定，避免相关成分分解影响测定结果的准确性。

3.5 柱温的影响 比较不同的柱温25、30、35和40 ℃对样品色谱中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B 4种色谱峰分离情况的影响，结果以25 ℃分离效果最好。

3.6 不同成分含量的比例 样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B 4种成分含量的比例约为1.2∶0.04∶1∶17，其中丹酚酸B的含量最高。

1 严红，高扬，郭伟，等.不同产地丹参药材中丹参酮ⅡA及丹参素的含量比较[J].天津药学，2003,15(3):10-12

2 杨菲，王智民，张启伟，等.“一测多评”法测定丹参酚酸类成分的含量[J].中国中药杂志，2011,36(7):2372-2379

3 程月发，蓝建芳，任新平，等.丹参胶囊质量标准研究[J].医药导报，2014,33(6):785-789

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2015-06-17

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1006-5687(2016)01-0003-03