MicroRNA-134在骨肉瘤中的表达及生物学作用研究

阿布都艾尼·热吾提，孙俊刚，瓦热斯江·尼亚孜，王浩，袁宏

(新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心关节外科，新疆 乌鲁木齐　830001)



MicroRNA-134在骨肉瘤中的表达及生物学作用研究

阿布都艾尼·热吾提，孙俊刚，瓦热斯江·尼亚孜，王浩，袁宏*

(新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心关节外科，新疆 乌鲁木齐830001)

摘要：目的检测微小RNA-134(microRNA-134)在骨肉瘤的表达，并探究其在骨肉瘤细胞的生物学作用。方法收集40 例骨肉瘤及癌旁正常骨组织标本，利用荧光定量PCR(Quantitative RT-PCR)检测microRNA-134的表达情况。进一步分析microRNA-134在骨肉瘤细胞系(HOS和Saos-2)及正常成骨细胞系(NHOst)的表达，进而通过转染microRNA-134 mimics至HOS和Saos-2细胞，并应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法、细胞划痕以及凋亡试验探究其对骨肉瘤细胞的生物学作用。结果MicroRNA-134在骨肉瘤组织标本中的表达量明显低于配对的癌旁组织(P<0.01)，同样microRNA-134在HOS和Saos-2细胞系中的表达亦低于NHOst细胞系(P<0.05)。细胞生物学功能实验发现，过表达microRNA-134可显著抑制HOS和Saos-2细胞的增殖及迁移能力，并增加凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(BAX)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASPASE-3)表达。结论MicroRNA-134在骨肉瘤组织及细胞系中明显低表达，并具有抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及增加凋亡的功能，高度提示其作为抑癌因子参与骨肉瘤的发生和发展过程。

关键词：microRNA-134；骨肉瘤；Quantitative RT-PCR；低表达；抑癌因子

骨肉瘤是恶性度高的实体肿瘤，常好发于胫骨近端和股骨远端等长管状骨的干骺端[1]。骨肉瘤的发病率占人类恶性实体肿瘤的0.2%左右，在所有原发性的恶性骨肿瘤中，其发病率占第一位[2]。近年来，由于新型辅助化疗技术的不断发展和各类手术方式的不断创新，对于没有发生转移的骨肉瘤患者，其5年生存率能够达到70%左右，但总体而言，骨肉瘤的病死率及转移率仍非常高[3]。虽然临床研究发现某些致癌因子或抑癌因子在骨肉瘤的发生发展中起着重要作用，但到目前为止，骨肉瘤发生的具体机制仍不明确[4-5]。所以，针对加强骨肉瘤发病分子机制的研究显得尤为重要。

微小RNA分子(microRNA，miRNA)是一段长度约为21-25核苷酸的小型非编码RNA家族分子，其广泛参与到细胞分化、生物发育及肿瘤形成等各种生物学过程中[6]。目前研究表明，miRNA分子对骨肉瘤的发生发展及预后具有重要的作用。例如，microRNA-124可通过下调酪氨酸激酶样孤儿受体(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2)介导的Wnt信号通路抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[7]。MicroRNA-214通过作用于下游分子人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)进而调控骨肉瘤细胞的生长及恶性转移[8]。在骨肉瘤中，体内及体外实验证明microRNA-140可显著抑制细胞的增殖及迁移[9]。

MicroRNA-134属于miRNA家族的成员之一，研究发现，microRNA-134低表达于胶质瘤中，并与肿瘤的恶性程度及转移密切相关[10]。MicroRNA-134通过下调蛋白O-葡萄糖基转移酶1(Protein O-glucosyltransferase 1，POGLUT 1)基因和Notch信号通路抑制子宫内膜癌的生长及肿瘤形成[11]。MicroRNA-134调控肺癌细胞的生长及凋亡，通过作用于WWOX基因(WW domain containing oxidoreductase，WWOX)和ERK1/2信号通路[12]。目前关于microRNA-134在骨肉瘤的研究尚未见相关文献报道，本研究旨在分析microRNA-134在骨肉瘤组织和细胞中的表达情况，并探究microRNA-134在骨肉瘤细胞中的生物学功能。

1资料与方法

1.1病例及组织标本的收集2012年1月至2014年12月于新疆维吾尔自治区人民医院收集40 例骨肉瘤及癌旁正常骨组织标本，每一例标本均经本院病理科进行病理确诊。其中男20 例，女20 例，平均年龄(52±3.4) 岁(28～63 岁)，中位年龄(48±4.6) 岁。标本的收集均经本医院医学伦理委员会认可并获得患者知情同意。

1.2实验试剂和相关仪器总RNA提取试剂Trizol，细胞培养基DMEM，胎牛血清FBS，蛋白裂解液RIPA及Lipofetamine 2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit，荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix EX TaqTM ⅡPCR Kit及PCR扩增引物均购自日本Takara公司。MicroRNA-134模拟物(mimics)及模拟物阴性对照(mimics control)合成于上海吉玛基因公司。骨肉瘤细胞系(HOS 和Saos-2)及正常成骨细胞系(NHOst)购自中科院上海细胞库。普通PCR仪来源于美国BIO-RAD公司。LightCycler480荧光定量PCR仪购自德国Roche公司。

1.3标本总RNA的提取及cDNA的合成选取液氮保存的40 例配对骨肉瘤及癌旁组织，依照Trizol试剂盒说明书，提取组织中的总RNA。遵照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒说明将lμg RNA逆转录为cDNA。合成的cDNA放置于-80℃冰箱保存备用。

1.4Quantitative RT-PCR按照SYBR®Premix EX TaqTMⅡPCR Kit试剂盒说明书，以合成的cDNA作为模版在LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行Quantitative RT-PCR反应。反应总体系为：模版cDNA 1 μL，microRNA-134特异性引物0.2 μL，2×SYBR®Premix Mix 10 μL，microRNA-134上游引物为5′-GACTGGTTGACCAGAGGGGC-3′，下游引物为Takara公司试剂盒提供的通用引物；以U6为内参，U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，最后加RNase-free water至反应总体积为20 μL。Quantitative RT-PCR反应条件为：95℃ 20 min，随后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共45个循环。最后采用 ΔΔCT法计算 Quantitative RT-PCR所得实验数据[13]。

1.5细胞培养和细胞转染实验所用HOS，Saos-2及NHOst细胞均采用DMEM培养基+10% FBS进行培养。细胞培养条件为37℃，5% CO2。实验均分为2组，其中试验组转染microRNA-134 mimics，阴性对照组转染mimics control。细胞铺板后，按照上述分组采用Lipofetamine 2000转染试剂进行细胞转染，之后按照相应实验需要进行处理。

1.6Western blot按照蛋白裂解液RIPA说明书，提取处理后的HOS和Saos-2细胞的总蛋白。将提取好的总蛋白使用BCA定量试剂盒定量到2 μg/μL，按比例加入5倍SDS上样缓冲液，105℃加热15 min使其完全变性。常规制备10% SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量25 μL，随后电泳、转膜、封闭，加入抗BAX(ab32503，1︰1 000稀释)及CASPASE-3抗体(ab2171，1︰1 000稀释)，4℃过夜并室温孵育相应的二抗1h，随后使用TBST洗涤3次，ECL发光液处理后暗室内曝光胶片。

1.7细胞增殖试验将HOS和Saos-2细胞培养后，按照96孔板进行铺板，并使每孔细胞数达到5 000～6 000个。之后按照上述实验分组进行转染，并连续4 d每天每孔加入16 μL四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(5 g/L，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)与细胞共孵育4 h后弃上清，最后使用150 μL二甲亚砜溶解，并测各孔450 nm波长的吸光度，计算各组平均值并绘制生长曲线。

1.8细胞划痕试验将培养好的HOS和Saos-2细胞消化后，按照6 孔板进行铺板，并使每孔细胞数约为2×105个，当细胞完全贴壁后，用消毒过的100 μL枪头均匀划出4条横线，随后以PBS洗细胞3次去除杂质。之后按照同样的方法进行实验分组并进行细胞转染。在转染后0 h及24 h进行拍照，观察和测定各组划痕闭合宽度。

1.9数据处理及统计学分析所有数据均为计量数据，表示为均数±标准差(mean±SD)。统计分析采用SPSS 17.0软件，两组均数比较采用两个独立样本的Student′s检验，MTT实验采用ANOVA检验。P<0.05为差异有统计学意义。所有的实验至少独立重复3次。

2结果

2.1MicroRNA-134在骨肉瘤组织及细胞系中低表达经Quantitative RT-PCR分析发现，40 例骨肉瘤组织中microRNA-134的相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.01)。同样骨肉瘤细胞系(HOS和Saos-2)中microRNA-134的表达量亦低于正常成骨细胞系(NHOst，P<0.05)，见图1。

2.2MicroRNA-134 mimics促进HOS和Saos-2细胞中microRNA-134表达采用microRNA-134 mimics和mimics control转染HOS和Saos-2细胞。48 h后，经Quantitative RT-PCR分析发现，microRNA-134 mimics可显著促进HOS和Saos-2细胞中microRNA-134的表达。结果见图2。两组差异有统计学意义(P<0.001)。

2.3MicroRNA-134抑制HOS和Saos-2细胞的增殖细胞增殖曲线显示结果见图 3。MicroRNA-134 mimics转染组细胞增殖速度明显降低，转染后1、2、3 d HOS细胞生长抑制率

注：*P<0.05

图1MicroRNA-134在骨肉瘤组织及细胞系中的表达情况

注：*P<0.01

图2MicroRNA-134 mimics促进HOS和Saos-2细胞中microRNA-134表达

[1-(microRNA-134 mimics/mimics control)×100%]分别为4.36%、7.29%和14.25%，以转染后3d 最高(见图3a)。Saos-2细胞转染后1、2、3d细胞生长抑制率分别为6.27%、8.92%和17.18%(见图3b)。

注：*P<0.05

图3MicroRNA-134对HOS和Saos-2细胞增殖的影响

2.4MicroRNA-134抑制HOS和Saos-2细胞的迁移HOS和Saos-2细胞铺板后，采用细胞划痕试验检测microRNA-134对其迁移的影响。结果见图4。24 h后，mimics control组HOS细胞划痕闭合约54%，microRNA-134 mimics组HOS细胞划痕闭合约38%；microRNA-134 mimics组Saos-2细胞划痕闭合约43%，mimics control组Saos-2细胞划痕闭合约67%。HOS和Saos-2细胞中microRNA-134 mimics组与mimics control组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

注：*P<0.05

图4MicroRNA-134对HOS和Saos-2细胞迁移的影响

2.5MicroRNA-134促进HOS和Saos-2细胞中凋亡相关蛋白BAX及CASPASE-3的表达为进一步验证microRNA-134对HOS和Saos-2细胞凋亡的影响，我们采用Western blot检查其对凋亡相关蛋白BAX及CASPASE-3表达的影响。结果见图 5所示。转染microRNA-134 mimics后HOS细胞中BAX及CASPASE-3蛋白的表达水平分别增加3.67和3.04倍；Saos-2细胞中BAX及CASPASE-3蛋白的表达水平分别增加2.25和4.03倍。

图5　MicroRNA-134对HOS和Saos-2细胞调亡的影响

3讨论

动物生长发育过程与细胞增殖、分化及凋亡行为密切相关，而异常的细胞增殖分化往往导致肿瘤的发生发展[14]。研究发现，成熟miRNA分子通常在转录后水平调控目的基因的表达。其主要通过与目的基因mRNA的3′UTR区域完全或不完全互补配对，进而降解目的基因mRNA或阻碍其蛋白的表达[15]。最近研究显示，miRNA可以作为抑癌和/或促癌因子在各种肿瘤发生过程中发挥抑癌和/或促癌功能。例如microRNA-34a能够诱导细胞周期停滞、阻滞细胞增殖并促进细胞凋亡[16-19]，Let-7主要通过下调肺癌组织中的Ras基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，Ras)的表达来抑制细胞的生长及肿瘤的迁移[20]。MicroRNA-372与microRNA-373可以促进肿瘤细胞的生长，其主要通过激活细胞周期蛋白依赖激酶CDK2(Cyclin-dependent kinase 2)来直接抑制抑癌基因LATS2(Large tumor suppressor kinase 2)的活性[21]。毫无疑问，探讨miRNA与肿瘤的关系，对于系统的掌握miRNA分子在肿瘤细胞中的功能及分子机制将起重要作用[22]。

MicroRNA-134定位于人染色体14q32位置，已有研究发现microRNA-134在多种肿瘤中呈现低表达，并发挥抑癌基因的作用。本研究通过对已经发表的骨肉瘤miRNA表达谱芯片结果进行分析[23]，初步确定microRNA-134为本实验的主要研究对象。通过对骨肉瘤组织和相应癌旁组织以及骨肉瘤与正常成骨细胞系中差异表达的microRNA-134进行定时荧光定量PCR验证和比较，发现microRNA-134确实低表达于骨肉瘤组织及细胞系中。因此我们猜测microRNA-134在骨肉瘤中亦发挥抑癌基因的作用。

为了进一步验证上述设想，我们应用MTT、细胞划痕以及凋亡试验探究microRNA-134对骨肉瘤细胞的影响。非常有趣的是，我们发现过表达microRNA-134，可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖及迁移并诱导其凋亡。上述结果提示microRNA-134可能作为抑癌基因参与骨肉瘤的发生和发展。

综上所述，本试验观察到microRNA-134低表达于骨肉瘤组织及细胞系，并初步揭示了microRNA-134具有抑制骨肉瘤细胞增殖及迁移并诱导其凋亡的作用。MicroRNA-134有望成为骨肉瘤诊断和治疗的肿瘤分子标志物，也可能作为骨肉瘤基因治疗的一个有效靶点。然而，关于microRNA-134在骨肉瘤中精确的分子机制还有待于进一步的研究。

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The Expression and Biological Function Studies of MicroRNA-134 in Osteosarcoma

Abuduaini·Rewuti，Sun Jungang，Waresijiang·Niyazi，etal

(Department of Orthopaedics，People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China)

Abstract：ObjectiveTo detect the expression of microRNA-134 in osteosarcoma and explore its biological function in osteosarcoma cell lines.Methods40 cases of paired osteosarcoma tissues and adjacent matched normal osteosarcoma tissues were collected in our hospital and microRNA-134 expression was detected by using Quantitative RT-PCR analysis.The expression levels of microRNA-134 was also analyzed in osteosarcoma cell lines (HOS and Saos-2)and a normal osteoblast cell (NHOst).The cells biological function was assessed by using MTT，wound-healing and Western blot assays，after transfected with microRNA-134 mimics into HOS and Saos-2 cells.ResultsThe microRNA-134 expression in osteosarcoma tissues was significantly lower than paired normal tissues (P<0.01)，and its expression was also down-regulated in HOS and Saos-2 cell lines than NHOst cell (P<0.05).Over-expression of microRNA-134 could markedly inhibit cell proliferation and migration，and promote BAX and CASPASE-3 expression.ConclusionMicroRNA-134 was significantly down-regulated in osteosarcoma tissues and cell lines.MicroRNA-134 can inhibit osteosarcoma cells proliferation and migration，and induce osteosarcoma cells apoptosis，which suggest that microRNA-134 function as a tumor suppressor gene involved in osteosarcoma development.

Key words：microRNA-134；osteosarcoma；Quantitative RT-PCR；low expression；tumor suppressor gene

作者简介：阿布都艾尼·热吾提(1982- )，男，主治医师，新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心关节外科，830001。

收稿日期：2015-09-06

中图分类号：R738.1

文献标识码：A

文章编号：1008-5572(2016)04-0331-05

*本文通讯作者：袁宏