DC-CIK联合氟达拉滨治疗老年慢性淋巴细胞白血病的临床研究*

孙薏　席洁琳　苏毅　钟国成　张明慧　岳伦莉　王奎

(1.解放军第452医院 血液肿瘤科，四川 成都 610021；2.成都军区总医院 血液科，四川 成都 610083)



·论著·

DC-CIK联合氟达拉滨治疗老年慢性淋巴细胞白血病的临床研究*

孙薏1席洁琳1苏毅2钟国成1张明慧1岳伦莉1王奎1

(1.解放军第452医院 血液肿瘤科，四川 成都 610021；2.成都军区总医院 血液科，四川 成都 610083)

【摘要】目的分析树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)为效应细胞的过继免疫疗法(DC-CIK免疫治疗)联合氟达拉滨治疗老年慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的免疫效应和临床疗效。方法将48例老年CLL患者分为化疗组21例，行氟达拉滨单药化疗和联合组27例，除接受氟达拉滨化疗外，还给予DC-CIK免疫治疗。并检测两组患者治疗前后的免疫学指标，比较治疗后两组患者的临床疗效、骨髓抑制及感染发生情况。结果治疗前，两组患者的免疫学指标差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，联合组患者血清Hsp70、Thl/Th2水平均较化疗组显著增加(P<0.05)；TGF-β、CD4+CD25+Treg阳性率较化疗组显著降低(P<0.05)。治疗后，联合组患者的PS评分、LDH等指标均优于化疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后，化疗组Ⅲ°及Ⅳ°骨髓抑制发生率差异无统计学意义(P>0.05)，感染发生率明显高于联合组，差异具有统计学意义(P<0.05)。总反应率联合组OR为77.78%，化疗组OR为66.67%，差异无统计学意义(P>0.05)。结论DC-CIK免疫治疗与氟达拉滨联合应用于老年CLL患者具有良好的协同疗效，是治疗老年CLL患者的可选方法之一。

【关键词】慢性淋巴细胞白血病(CLL)； 免疫疗法； 树突细胞； 杀伤细胞；化疗

慢性淋巴细胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL) 是一种恶性的淋巴细胞克隆增殖性疾病，其发病呈逐渐上升趋势，以老年患者居多，中位发病年龄为72岁[1-3]。近年来，嘌呤类似物氟达拉滨用于老年CLL的治疗，取得了较高的缓解率[4]。但由于老年CLL患者生理及免疫功能退化，骨髓抑制等因素，常导致化疗后骨髓抑制更加明显，病人感染严重，危及生命。研究发现过继免疫治疗联合化疗具有协同抗肿瘤作用，同时，可增强化疗后患者的免疫功能。过继免疫很可能成为CLL未来的突破方向之一。DC细胞在机体特异性抗瘤应答过程中起到了重要的作用，同时也是已知功能最强的抗原递呈细胞。CIK细胞是在体外培养获得的一群异质细胞，具有强大的肿瘤杀伤活性。本研究旨在探讨DC-CIK联合氟达拉滨治疗老年慢性淋巴细胞白血病的临床疗效，现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料2009年3月～2013年6月在我院和成都军区总医院治疗的老年CLL患者共48例纳入研究，根据患者就诊的顺序，采用数字表法随机分为化疗组21例和联合组27例。所有患者按Binet分期均为B～C期，其中B期28例，C期20例，初治患者33例，复发或难治性患者15例。两组患者的年龄、性别、分期等，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。纳入标准：①年龄>60岁。②按照张之南“血液学诊断及疗效标准”(第3 版)确诊为慢性淋巴细胞白血病[5]。③体力状态(performance status，PS)评分为0～2分。④满足化疗和免疫治疗适应证并愿意接受治疗。⑤预测生存期>3个月。⑥签署知情同意书。⑦能配合研究及随访观察者。排除标准：①患精神障碍疾病者。②有严重的心、肝、肾及胃肠等功能异常者。③有活动性重复癌者。④合并活动性结核及其他严重的感染性疾病者。⑤3周内接受过大手术和(或)放疗。⑥过敏体质或对多种药物过敏者。本研究通过了医院医学伦理委员会的批准。

表1　治疗前两组患者一般资料比较(n)

1.2方法

1.2.1DC和CIK的体外诱导参考相关文献[6，7]将联合组患者的外周血单个核细胞(PBMNC)分离出来，分离个数约(1.0～5.0)×1010/L，然后将分离出的这些细胞贴壁2小时，再将其中的悬浮细胞去除，并加入GM-CSF和IL-4(Peprotech公司产品)以诱导DC；将去除的悬浮细胞加入到含有IFN-γ、抗CD-3单克隆抗体、IL-2、IL-1的RPMI 1640培养液(Hyclone公司产品) 中以诱导CIK。

1.2.2治疗方案化疗组患者接受氟达拉滨单药化疗，氟达拉滨25 mg/(m2·d)，静脉输注，连用5天，28天为1个周期。联合组除接受氟达拉滨单药化疗外，同时接受DC-CIK过继免疫治疗。为避免化疗对PBMNC的抑制，联合组患者于第1天化疗前2 h采集PBMNC，然后开始化疗周期。将分离的PBMNC在体外进行细胞诱导培养，培养第7天，将DC与CIK按1∶10的比例混合培养，在化疗的第9～14天(分6次，1次/日)回输给患者，每次回输细胞(2.5～5.0)×109/L (内毒素和无菌检测依据“中华人民共和国药典”2005版)。回输时将细胞离心洗涤，于100ml生理盐水重悬后2h内静脉滴注完毕 。联合组患者均接受了3个周期以上的免疫治疗。

1.3观察指标

1.3.1免疫指标比较分别于治疗前1天和治疗后3个月，用定量ELISA试剂盒(Pharmingen公司产品)测定两组患者的血清热休克蛋白(Hsp)70、Thl/Th2比值、TGF-β水平；用流式细胞术检测患者外周血调节性T细胞表面标志CD4+CD25+阳性率。

1.3.2临床指标比较 分别于治疗前和治疗后3个月记录两组患者的PS评分、检测LDH水平。

1.3.3治疗后骨髓抑制及感染发生情况比较 记录治疗后两组患者骨髓抑制及感染的发生情况。

1.3.4两组患者临床疗效比较 临床疗效参照张之南《血液病诊断及疗效标准》(第3版)标准评判：分为完全缓解(complete response，CR)、部分缓解(partial remission，PR)，总反应(overall remission，OR) 率为CR+PR。

1.3.5不良反应监测 治疗期间监测患者体温、脉搏、呼吸和血压变化。不良事件依据CTCAE(Corn-non Terminology Criteria for Adverse Events)3.0版标准进行记录。

1.4统计学分析采用SPSS17.0软件对数据进行统计学处理。生存期分析采用Kaplan-Meier方法，Log-Rank检验；计数资料采用2检验；正态计量资料用均数±标准差±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫指标比较治疗前，两组患者的外周血Hsp70、Thl/Th2、TGF-β、CD4+CD25+阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，联合组患者血清Hsp70、Thl/Th2水平均比化疗组增加(P<0.05)；TGF-β、CD4+CD25+阳性率比化疗组降低(P<0.05)，见表2。

2.2临床指标比较治疗后3个月，联合组患者的体力状态(PS)评分、乳酸脱氢酶(LDH)等指标均优于化疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2　治疗前后两组患者免疫学指标比较

表3　两组患者PS评分和实验室指标比较±s)

注：与化疗组比较，①P<0.05。

2.3治疗后两组患者骨髓抑制及感染发生情况比较化疗组Ⅲ°及Ⅳ°骨髓抑制发生率与联合组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但化疗组感染发生率明显高于联合组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4　两组患者骨髓抑制及感染发生情况比较[n(×10-2)]

注：与化疗组比较，①P<0.05

2.4两组患者疗效比较治疗3个月后联合组27例患者中CR8例(29.63%)，PR13例(48.15%)，OR21例(77.78%)；化疗组21例患者中CR6例(28.57%)，PR8例(38.10%)，OR14例(66.67%)；两组患者OR差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5不良反应联合组有4例患者在细胞回输后出现短暂的畏寒、低热，对症处理后症状消失，且再未发生。

3讨论

慢性淋巴细胞白血病是一种B淋巴细胞克隆性增殖恶性血液系统疾病，在西方国家较为常见，近年来，随着我国人口老龄化，其在我国的发病率有上升趋势。CLL传统的一线治疗方案为苯丁酸氮芥、COP方案、CHOP方案，近年来以氟达拉滨为代表的核苷类似物在治疗CLL上较以往有了很大进步。但老年CLL患者生理及免疫机能均退化，常常合并一种或多种慢性基础疾病，且进展期CLL患者的骨髓造血和免疫功能均受到不同程度地抑制，导致患者对化疗的耐受性明显降低。故探索化疗之外的新的治疗方案( 如生物治疗、免疫治疗和靶向治疗等) 对于改善老年CLL患者的预后具有重要意义。

DC细胞是主动和特异性免疫的关键，而CIK细胞是目前肿瘤杀伤活性最强的效应细胞。理论上，以DC-CIK过继免疫治疗CLL具有以下优势[8]：①体内瘤抗原被DC摄取后呈递给CIK，可使CIK活化并主动杀伤瘤细胞。②CIK同时表达CD3和CD56，既有T淋巴细胞的抗瘤活性，又具备NK细胞的非MHC限制性杀瘤特性。③DC-CIK具有强大的免疫支持作用，可以在一定程度上修复患者的免疫缺陷。④降低化疗副反应发生率(CIK具有保肝和升白细胞作用)；⑤DC-CIK来源于PBMNC，无异体排斥，安全性好。

然而，这种治疗方案受到多种因素的限制[9]：由于体内肿瘤环境的免疫抑制，回输的DC-CIK细胞无法保持相应的抗肿瘤活性；此外，由于体内瘤负荷太重导致效靶比低下，无法清除成块的瘤灶。故有机整合不同治疗方法的优势，才可能不断提高CLL的临床疗效。传统观点认为，化疗可诱发骨髓抑制，损伤免疫系统，削弱免疫应答。我们分别检测了两组患者化疗前后Hsp70、Thl/Th2比值、CD4+CD25+细胞率、TGF-β水平，其中Hsp70能够反映抗原激发免疫应答的能力；Thl/Th2比值反映体内抗肿瘤免疫状态；CD4+CD25+细胞率反映了血液中调节性T细胞(Regulatory cell ，Treg )的比例；而TGF-β是由肿瘤细胞产生的一种免疫抑制因子。我们发现化疗后患者的Hsp70、Th1/Th2升高，而Treg比例和TGF-β含量减低；与化疗组相比，联合治疗组的Hsp70、Th1/Th2升高，CD4+CD25+细胞阳性率，TGF-β水平降低。提示化疗可降低肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子，减少调节性T细胞的数目，进而打破免疫耐受，促进免疫细胞及回输的DC-CIK在体内的快速增殖并活化；化疗促使肿瘤细胞裂解释放肿瘤抗原，进一步增强免疫细胞对肿瘤的识别和杀伤作用[10-13]。这充分说明DC-CIK过继免疫治疗联合化疗协同作用，可提高机体的免疫状态。

LDH、PS评分、OR等指标与CLL的病情发展及疗效判断密切相关。本研究结果显示，在LDH和PS评分上，对照组：PS评分(2.61±0.42)、LDH(236±23.88)mmol/L；联合组：PS评分(2.19±0.33)、LDH(176±24.18)mmol/L，联合组与对照组比较具有统计学差异，进一步证实联合组较对照组疗效有所提高，且能改善患者临床症状。联合组Ⅲ°及Ⅳ°骨髓抑制发生率低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)；感染发生率明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。在骨髓抑制无明显差异的情况下患者感染率明显下降，这说明DC-CIK可通过打破机体免疫抑制状态来提升患者免疫潜能。在化疗疗效上比较，联合组OR为77.78%，化疗组OR为66.67%，联合组较对照组疗效有所提升，然而考虑纳入病例数有限的原因，我们没有得出统计学差异。本研究结果提示：化疗可以减轻体内肿瘤负荷，DC-CIK可以在此基础上进一步杀灭隐匿潜在的癌细胞，增强患者的免疫功能，减轻毒副损伤[14]，从而提高生活质量和临床疗效。二者的结合具有良好的协同效果。

4结论

氟达拉滨联合DC-CIK治疗老年CLL能下调老年CLL患者肿瘤细胞的免疫抑制，二者具有良好的协同作用，这为老年CLL患者提供了新的治疗途径，具有良好的临床应用前景。但本研究病例数较少，其确切的作用机制及联合治疗方案优化等问题还需要深入地研究和论证，同时二者联合运用可能存在的风险与不确定性仍需长期的临床观察与探索。

【参考文献】

[1]Ferlay J，Bray F，Pisani P，etal. GLOBOCAN 2002: Cancer Incidence，Mortality and Prevalence Worldwide[M].IARC Cancer Base No.5 Version 2.0. Lyon，France：IARCPress，2004.

[2]Horner M，Ries L，Krapcho M，etal.SEER Cancer Statistics Review，1975 -2006[M].Bethesda，MD：National Cancer Institute，2009.

[3] Rozman C，Montserrat E. Chronic lymphocytic leukemia[J]. N Engl J Med，1995，333( 16) ：1052 -1057.

[4]王欣，刘林，陈建斌，等. 氟达拉滨联合环磷酰胺治疗慢性淋巴细胞白血病的临床研究[J]. 重庆医学，2009，38( 10) : 1211-1212.

[5]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].第3 版. 北京: 科学出版社，2007：139.

[6]孙薏，张聪，陈健，等．自体树突细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞过继治疗复发难治性骨髓瘤26例[J].解放军医学杂志，2011，36(11)：1245-1246.

[7]Zhong G，Wang J，Xu M，etal．Enhanced maturation and functional capacity of dendritic cells induced by mannosylated L2 domain of ErbB2 receptor[J].Scand J Immanol，2005，62(2)：108-116.

[8]Rosenblatt J，Avigan D．Cellular immunotherapy for multiple mye-loma[J].Best Pract Res Clin Haematol,2008，21(3)：559-577.

[9]Huang X，Huang G，Song H，etal. Preconditioning chemotherapy with paclitaxel and cisplatin enhances the antitumor activity of cytokine induced-killer cells in a murine lung carcinoma model[J]. Int J Cancer，2011，129(3)：648-652.

[10] 龚非力. 医学免疫学[M].第3版.北京: 科学出版社, 2009: 122-123.

[11] Beyer M， Kochanek M，Darabi K，etal． Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine[J]. Blood，2005，106(6)：2018-2025.

[12] Wang X，Zheng J，Liu J，etal. Increased population of CD4(+)CD25(+)，regulatory T cells with their higher apoptotic and proliferating status in peripheral blood of acute myeloid leukemia patients[J]. Eur J Haematol，2005，75(6)： 468-476.

[13] 黄建霞, 张连生, 易良才, 等. 急性白血病患者外周血Treg细胞与Th17 细胞的相关性[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，2011，17(4):430-433.

[14] 吕章春，陈海祥，李可，等. 经诱导健康人与肿瘤患者CIK 和DC-CIK对肺癌细胞杀伤作用的比较研究[J]. 肿瘤学杂志，2009，15(6): 530-533.

The clinical study of DC-CIK combined with fludarabine in treatment of elderly chronic lymphocytic leukemia

SUN Yi1,XI Jielin1,Zhong Guocheng1,et al

(1.DepartmentofHematologyandOncology,PLA452Hospital,Chengdu610021,China；2.DepartmentofHematology，GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion，Chengdu610083,China)

【Abstract】ObjectiveThis study was aimed to evaluate the immunological effect and clinical effect of immunotherapy which consist of dendritic cells (DC) and cytokine-induced killer cell(CIK) combined with fludarabine on senile patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL). Methods48 senile patients with CLL were assigned to chemotherapy group and joint group. 21 patients of chemotherapy group were treated by fludarabine only. 27 patients of joint group were treated by adoptive immunotherapy (DC-CIK) combined with fludarabine. At the same time, a variety of immunological indexes of all patients before and after treatment were recorded. After treatment, the clinical effect, myelosuppression and infection between two groups was compared. ResultsAfter treatment, the immunological indexes of all patients were better than that before treatment (P<0.05). After treatment, the incidence of III°and IV°of myelosuppression in chemotherapy was higher than that of the joint group, but there was no significant difference(P>0.05). The infection incidence of chemotherapy group was significantly higher than that of joint group (P<0.05). After treatment, the quality of life and clinical index in joint group were better than that of chemotherapy group (P<0.05). The overall response (OR) rate of the joint group and chemotherapy group were 77.78% and 66.67%, respectively (P>0.05). ConclusionFludarabine and DC-CIK have good synergistic therapeutic effect for elderly CLL.

【Key words】Chronic lymphocytic leukemia； Immunotherapy； Dendritic cells； Cytokine-induced killer cell； Chemotherapy

(收稿日期：2015-07-07； 编辑： 陈舟贵)

【中图分类号】R 733.7

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.015

通讯作者：苏毅,E-mail:suhang1234@hotmail.com;钟国成,E-mail:18716354367@163.com

基金项目：四川省卫生厅科研课题(110490)