红景天注射液HPLC指纹图谱研究

杨胜岩，赵国华，王仁久，房宗宝，吴海波，刘倩，唐铖，3，段宏泉，3

（1.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.通化玉圣药业有限公司，通化134000；3.天津医科大学基础医学研究中心，天津300070）

论著

红景天注射液HPLC指纹图谱研究

杨胜岩1，赵国华2，王仁久2，房宗宝2，吴海波2，刘倩1，唐铖1，3，段宏泉1，3

（1.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.通化玉圣药业有限公司，通化134000；3.天津医科大学基础医学研究中心，天津300070）

目的：建立红景天注射液的色谱指纹图谱，为红景天注射液的质量控制提供依据。方法：采用高效液相色谱法进行检测，以Agilent XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱为固定相，乙腈-水（0.07%磷酸）为流动相进行梯度洗脱，流速0.8 mL·min-1，检测波长278 nm，柱温30℃；以中国药典指纹图谱相似度评价系统（2004版）对注射液进行指纹图谱数据分析。结果：所建立的色谱条件能够有效分离红景天注射液的主要成分，确定了6个共有峰，以化学对照品比对结合HPLC-MS鉴定了其中5个色谱峰，分别为没食子酸、对羟基苯甲酸、酪醇、红景天苷和对香豆酸。方法学考察结果表明，文中所建分析方法精密度RSD≤1.90%、重现性RSD≤0.32%、稳定性RSD≤1.63%，均符合要求。对9个批次注射液进行的指纹图谱分析结果表明相似度均大于0.96。结论：文中所建立的指纹图谱分析方法准确可靠，可以用于红景天注射液的质量控制。

红景天注射液；高效液相色谱指纹图谱；色谱峰鉴定；相似度评价

红景天（Rhodiola rosea L.）的主要成分为红景天苷、酪醇和酚酸类化合物等，具有抗疲劳、抗衰老、增强学习记忆、抑制肿瘤、提高免疫等多种功能[1-2]；其所含多元酚类化合物和黄酮类化合物具有抗氧化作用[3]，对心脑血管系统具有保护作用[4-5]；能扩张血管，增加冠脉血流量，减少心肌耗氧量，改善心肌微循环，从而改善心肌的供血供氧[6]，并能够增强机体对缺氧的耐受力，快速缓解心血管疾病症状。近些年来，已有将该药制成注射液应用于临床的报道[7]。中药注射液由于直接进入体内循环系统，其质量控制水平的提高对于保障质量，防止注射液不良反应的发生尤为重要。近年来，指纹图谱技术被逐步应用于中药注射液的质量控制，其优点在于可全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例，在大多数中药有效成分尚未阐明的现状下，仍可有效地表征中药质量。与现行的单一有效成分或指标性成分鉴定相比，指纹图谱所含的信息量更大，更为科学、合理[8]。本文采用高效液相色谱法建立红景天注射液指纹图谱分析条件，通过对多批次注射液分析确定共有峰，结合HPLC-MS和HPLC保留时间和对照品叠加试验方法对共有峰进行指认，进一步通过方法学考察建立色谱指纹图谱分析方法，为该产品的质量控制方法的改进提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 1200 series高效液相色谱仪，包括二元高压泵、柱温箱、自动进样器、紫外-可见光检测器，Agilent Chemstation工作站；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版（国家药典委员会）；分析天平（十万分之一，上海恒平科学仪器有限公司）。

红景天苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110818-201206）；酪醇对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111676-200602）；乙腈（色谱纯，百灵威公司）；超纯水（Merck Millipore Q-Gard T1）；其他试剂均为市售分析纯；红景天注射液(通化玉圣药业有限公司，批号：3001141104-1，3001141105-1，3001141201-1，3001141202-1，3001141204-1，3001141205-1，3001141206-1，3001141207-1，3001150105-1，3001150106-1，3001150107-1，3001150108-1，3001150109-1，3001150110-1，3001150201-1，3001150202-1，3001150203-1，3001150204-1，3001141103-1，3001141208-1，3001141209-1，3001141210-1，3001150101-1，3001150102-1，3001150103-1，1001150401-1，1001150402-1）。

1.2 方法

1.2.1 对照品及供试品溶液的配制 精密称取红景天苷对照品5.12 mg，酪醇对照品1.72 mg，分别置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别制得浓度为0.512mg·mL-1的红景天苷贮备液和0.172 mg·mL-1的酪醇贮备液。精密吸取红景天注射液1.0 mL，用超纯水稀释至10.0 mL，摇匀，所得溶液经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.2 色谱条件 本品含有的主要药效物质为红景天苷和酪醇等苯乙醇苷化合物，通过红景天苷、酪醇全波长扫描分析可知，上述化合物的最大吸收波长均在278 nm。故本文选择278 nm作为检测波长。固定相：Agilent XDB C18色谱柱（5 μm，250 mm× 4.6 mm）；流动相：A-乙腈，B-0.07%磷酸水溶液，梯度洗脱，0～10 min，0～0A；10～30 min，0～3%A；30～38min，3%～5%A；38～45min，5%～7%A；45～50min，7%～13%A；50～60min，13%～22%A；检测波长：278nm；进样量：20 μL；柱温：30℃；流速：0.8 mL·min-1。

1.2.3 色谱指纹图谱的建立

1.2.3.1 共有峰的确定：按照“1.2.2”项下色谱条件，分析18批注射液的色谱指纹图谱。

1.2.3.2 各色谱峰的化学成分鉴定：参照文献[9]并适当调整，建立质谱分析条件如下：（1）仪器一：Agilent 1200 series高效液相色谱仪，Bruker HCT Iontrap三维离子阱质谱仪，BrukerESICompass1.3for HCT/Esquire工作站；质谱条件：ESI源，负离子检测模式，扫描范围为m/z100～1000，毛细管电压为145 V，锥孔电压为30 V，脱溶剂气为氮气，350℃，8 L/min。（2）仪器二：Agilent 6520 QTOF四极杆-飞行时间串联质谱仪，Agilent MassHunter Workstation Qualitative Analysis工作站；质谱条件：ESI源，负离子检测模式，扫描范围为m/z 50～1 000，毛细管电压为200 V，锥孔电压为30V，脱溶剂气为氮气，180℃，6L/min。

1.2.4 色谱指纹图谱方法学考察

1.2.4.1 精密度试验：取同一批次红景天注射液1支，按“1.2.1项”下制备方法制备供试液；按“1.2.2项”下色谱条件，连续进样6次。

1.2.4.2 重现性试验：取同一批次红景天注射液6支，分别按“1.2.1项”下制备方法制备供试液6份；按“1.2.2项”下色谱条件，分别进样分析。

1.2.4.3 稳定性试验：取同一批次红景天注射液1支，按“1.2.1项”下制备方法制备供试液；按“1.2.2项”下色谱条件，分别于0、2、6、10、12、24 h进样分析。

1.2.5 对照图谱的生成和相似度评价 对18批红景天注射液按“1.2.2项”下色谱条件进行测定。将红景天注射液色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》研究，计算各样品指纹图谱与对照图谱的相似度。

1.2.6 市售样品指纹图谱的相似度评价 取市售该企业的9批注射液，按上文中建立的指纹图谱测定方法检测，将所得指纹图谱和上述红景天注射液对照指纹图谱通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版》对各图谱进行全谱匹配，计算各样品指纹图谱与对照图谱的相似度。

2 结果

2.1 色谱指纹图谱的建立

2.1.1 共有峰的确定 通过比较18批供试品色谱指纹图谱的共有色谱峰，选择稳定性好、吸收强、特征明显的色谱峰为共有峰，共标定6个峰，见图1。

图1 红景天注射液的色谱指纹图谱Fig 1 The chromatographic fingerprint of Hongjingtian injection

2.1.2 各色谱峰的化学成分鉴定 通过分子离子峰与红景天化学成分比较分析，分子离子峰提取TIC峰与UV色谱峰保留时间比对，鉴定了5个化学成分，见表1。

表1 5个共有色谱峰的化学成分鉴定Tab 1 Identifyingchemicalconstituentsof5commonchromatographic peaks

进一步采用化学对照品的保留时间及与注射液叠加试验分析对比，最终确定本文鉴定的5个共有色谱峰的化学成分无误。

2.2 色谱指纹图谱方法学考察

2.2.1 精密度试验结果 对共有峰进行比较，选定第5个共有峰红景天苷为参照物峰（S峰），结果显示各共有峰相对保留时间RSD≤0.16%，各共有峰相对峰面积RSD≤1.90%，表明精密度良好。

2.2.2 重现性试验结果 各共有峰相对保留时间RSD≤0.17%，各共有峰相对峰面积的RSD≤0.32%，表明所建方法重现性较好。

2.2.3 稳定性试验结果 各共有峰相对保留时间RSD≤0.83%，各共有峰相对峰面积RSD≤1.63%。表明所建方法稳定性良好。

2.3 对照图谱的生成和相似度评价 对18批红景天注射液进行测定并将红景天注射液色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，研究结果见图2，相似度计算结果显示18批样品相似度均在0.9以上，平均为0.982，RSD为0.85%。生成红景天注射液对照指纹图谱见图3。

2.4 市售样品指纹图谱的相似度评价 各样品指纹图谱与对照图谱的相似度结果见表2，9批注射液相似度均高于0.970，表明不同批次红景天注射液相似度较高，指纹图谱相似性良好说明工艺较稳定。

图2 1～18批红景天注射液指纹图谱（R为对照指纹图谱）Fig 2 The fingerprints of the 1-18 batches of Hongjingtian injection(R is the control fingerprint)

图3 红景天注射液对照指纹图谱Fig 3 Control fingerprint of the Hongjingtian injection

表2 9批红景天注射液样品相似度评价结果Tab 2 Results for the similarity evaluation of the 9 batches of Hongjingtian injection

3 讨论

在检测波长选择方面：由于中药产品中存在的物质成分差别较大，指纹图谱样品在色谱响应行为上也有较大差别。因此检测波长的选择就显得尤为重要[10]。检测波长选择的主要原则是整体全面，尽可能减少数据间差别，达到最优化的显示[11]。本品主要化学成分为红景天苷和酪醇，两者最大吸收均为278 nm，结合DAD检测谱图中红景天各色谱峰随波长的峰高分布情况，研究表明该化合物在278 nm波长处色谱峰数目最多且峰面积最大，可满足有效指纹信息最大化原则，故最终确定以278 nm检测波长用于注射液的综合质量控制。

在色谱柱选择方面：本文分别采用Agilent XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）、AgilentXDBC18（150mm× 4.6mm，5μm）、AgilentZorbaxSBC18（250mm×4.6mm，5 μm）和Agilent Zorbax Extend C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）4种色谱柱，对同一批号的样品进行分析比较。结果显示红景天苷和酪醇在使用Agilent XDB C18分离时，可将各组分较好地分离，峰形良好并且分析时间较短，故最终选用Agilent XDB C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)进行指纹图谱检测。

在特征峰的指认方面，本文进一步做了HPLC叠加分析试验。众所周知，HPLC-MS联用技术虽然能够快速鉴定色谱指纹图中色谱峰所对应的化学成分结构，但是无法准确区别分子量相同而化学结构不同的化学成分，特别是中药化学成分组成复杂，同分异构体也很多，很难利用分子离子峰的裂解规律进行鉴定。现有文献报道常采用混合化学对照品分析，通过保留时间指认色谱峰所对应化学成分，但由于仪器分析精密度的局限性，如无法区分保留时间相差0.1～0.2 min的不同化学成分，而叠加试验则可以避免这类问题。本研究采用化学对照品与注射液叠加试验作为色谱峰鉴定的补充。上述两种方法相结合，鉴定的指纹图谱中色谱峰所对应化学成分准确、依据充分。

本文建立的HPLC测定红景天注射液指纹图谱的方法，能较为全面地反映红景天注射液的化学组成及其相对比例，有助于对药品质量进行整体描述和评价。

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（2015-09-15收稿）

Study on fingerprint of Hongjingtian injection by HPLC

YANG Sheng-yan1,ZHAO Guo-hua2,WANG Ren-jiu2,FANG Zong-bao2,WU Hai-bo2,LIU Qian1,TANG Cheng1,3,DUAN Hong-quan1,3
（1.Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics(Theranostics),School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Tonghua Yu Sheng Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tonghua 134000,China; 3.Research Center of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)

Objective：To establish a HPLC fingerprint method and improve the quality control of Hongjingtian injection.Methods：Agilent XDB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used as stationary phase.And water containing 0.07%phosphoric acid－acetonitrile system was utilized as a mobile phase,at the flow rate of 0.8 mL·min-1.The detection wavelength was 278 nm,and the column temperature was set at 30℃.All the data was analyzed by fingerprint evaluation system(2004).Results：Components of Hongjingtian injection were analyzed.Six common peaks were obtained for standard fingerprint chromatography and five of them such as gallic acid,p-hydroxybenzoic acid,tyrosol,salidroside,p-hydroxycinnamic acid were identified by HPLC-MS and standard compounds.The similarities of nine batches sample were above 0.96.Conclusion：HPLC fingerprint method is accurate and reliable,and could be used for the quality control of Hongjingtian injection.

Hongjingtian injection;HPLC fingerprint;chromatograpic peak identification;similarity evaluation

R9

A

1006－8147（2016）02-0164-04

杨胜岩(1991-),女,硕士在读,研究方向：中药现代质量控制与质量标准；通信作者：段宏泉,E-mail:duanhq@tijmu.edu.cn。