同型半胱氨酸代谢关键酶基因多态性与单纯收缩期高血压关系的初步研究

麻仕利，王伟，梁蓉

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市泰达国际心血管病医院心内五科，天津300457；3.天津市胸科医院综合病房，天津300222）

论著

同型半胱氨酸代谢关键酶基因多态性与单纯收缩期高血压关系的初步研究

麻仕利1，王伟2，梁蓉3

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市泰达国际心血管病医院心内五科，天津300457；3.天津市胸科医院综合病房，天津300222）

目的：探讨亚甲基-四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T、蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因A66G、蛋氨酸合成酶（MS）基因A2756G 3种同型半胱氨酸代谢相关酶基因多态性与单纯收缩期高血压（ISH）患者发病的关系。方法：以220例单纯收缩期高血压患者作为试验组对象，选择同期就诊的无高血压患者130例作为对照组，检测其血中同型半胱氨酸水平，并应用分子生物学方法对MTHFR C677T、MTRR A66G、MS A2756G 3个基因位点进行多态性检测。结果：（1）ISH组患者血中同型半胱氨酸水平[（14.81±5.88）μmol/L]高于对照组[（12.71±4.32）μmol/L]，有统计学意义（P＜0.05）；（2）ISH组患者MTHFR T/T及C/T基因型分布频率和T等位基因频率（分别为19.5%、60%、49.5%）均高于对照组（分别为15.4%、45.4%、38.1%）（P＜0.05）。（3）MS基因A2756G的各型基因型分布频率及等位基因频率与对照组比较差异无明显统计学意义。（4）ISH组患者MTRR基因A/G及G/G基因型分布频率和G等位基因分布频率低于对照组,但无统计学意义。结论：同型半胱氨酸对ISH的影响可能一部分是通过其关键酶基因的突变造成的；MTHFR基因C677T位点的突变可能是ISH的遗传危险因子；而MTRR基因A66G、MS基因A2756的多态性改变与ISH的发生可能无明显关系。

同型半胱氨酸；单纯收缩期高血压；蛋氨酸合成酶还原酶;蛋氨酸合成酶;亚甲基-四氢叶酸还原酶

大量研究表明，血浆中同型半胱氨酸（Hcy）水平高低与心脑血管疾病的发生关系密切，高水平的同型半胱氨酸血症是导致心脑血管疾病发生的重要独立的危险因素之一[1]。而导致血浆Hcy水平升高的因素很多，包括遗传因素、环境因素以及二者之间的相互作用。一方面，叶酸、维生素B12等B族维生素的缺乏可引起Hcy血浓度的变化，另一方面，Hcy代谢通路中的一些关键酶基因的遗传性改变，能导致其编码的相应酶蛋白活性的变化，进而影响到血浆的Hcy水平。亚甲基-四氢叶酸还原酶（MTHFR）、蛋氨酸合成酶（MS）、蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）均为Hcy代谢过程中的关键酶，本研究旨在探讨单纯收缩期高血压（ISH）患者以上3种关键酶基因的多态性与其发病的关联性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取近年在我院门诊就诊的220例ISH患者为ISH组，选取同期就诊的130例无高血压患者为对照组，入选者均为北方汉族人，经流行病学问卷调查和体格检查后，按照2013年中国高血压防治指南制定的高血压诊断标准，并除外肝、肾、自身免疫性疾病及继发性高血压。

1.2 方法

1.2.1 测量血压 采用符合计量标准的台式水银柱血压计，所有入选对象至少休息15 min后，坐位由专业人员测量右侧肱动脉血压，取Korotkoff第1和第5音为收缩压（SBP）和舒张压（DBP），连续测量3次，每隔2 min测量1次，取3次平均值为个体血压值。

1.2.2 DNA样品的制备 采用百泰克离心柱法DP5802提取全血DNA。

1.2.3 血浆Hcy水平及其他生化指标测定 分别抽取研究对象空腹外周血4 mL，0.5 h内离心，分离出血浆，用荧光偏振免疫分析法检测血浆Hcy，应用全自动生化仪检测血脂、尿酸等指标。

1.2.4 MTHFR基因 C677T、MS基因 A2756G、MTRR基因A66G基因多态性检测(PCR-RFLP法) 1.2.4.1 MTHFR基因片段PCR扩增:MTHFR基因C677T引物序列P1，5′-CCTTGAACAGGTGGAGGC C-3′；P2，5′-CAAAGAAAAGCTGCGTGAT-3′。PCR反应条件:94℃预变性8 min，94℃60 s，62℃60 s，72℃60 s，共35个循环，最后于72℃再延伸7 min (PCR扩增仪为 Biometra Tgradient)。反应结束，MTHFR基因扩增产物经限制性内切酶Hinf酶切，行PAGE凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射灯上显像并拍照以确定基因型。

1.2.4.2 MTRR基因片段PCR扩增:MTRR基因A66G引物序列P1，5′-CAGGCAAAGGCCATCGCAG AAGACAT-3′；P2，5′-CACTTCCCAACCAAAATTCT TCAAAG-3′。PCR反应条件:94℃预变性4min，94℃60s，60℃60 s，72℃60 s，共35个循环，最后于72℃再延伸5 min。反应结束，MTRR基因扩增产物经限制性内切酶NdeI酶切，行凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射灯上显像并拍照以确定基因型。

1.2.4.3 MS基因片段PCR扩增:MS基因A2756G引物序列P1，5′-CATGGAAGAATATGAAGATATTAGA C-3′；P2，5′-GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA-3′。PCR反应条件:94℃预变性8 min，94℃50 s，58℃60 s，72℃90 s，共35个循环，最后于72℃再延伸7 min。反应结束，MS基因扩增产物经限制性内切酶HaeIII酶切，行凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射灯上显像并拍照以确定基因型。

1.3 统计学处理 按Hardy-Weinberg遗传平衡定律检测样本的群体代表性。基因型及基因频率比较采用χ2检验。计量资料间比较采用成组资料的t检验；计数资料以s表示；多组间样本均数的比较采用单因素方差分析；多因素分析采用Logistic回归分析；连锁不平衡模式（LD）及单体型分析分别采用DataAnalyser0.34和Phase2.1软件。连锁不平衡系数（D’）＜0.2被认为不具有LD，D’＞0.5具有LD，D’＞0.8具有强LD，D’=1处于完全LD。使用SPSS17.0统计软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ISH组及对照组基本资料及相关生化指标的比较 见表1。ISH组与对照组一般资料比较，性别、年龄、吸烟比例均未见明显差异（P＞0.05），但ISH组患者糖尿病的患病率（28.2%）较对照组（14.6%）明显升高，两组差异比较有统计学意义（P＜0.05）；从表中还可以看出ISH组患者的同型半胱氨酸水平及超敏C反应蛋白（hs-CPR）水平高于对照组，两组比较有统计学意义（P＜0.05），而两组患者总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、尿酸均值水平比较虽ISH组＞对照组，但无统计学意义（P＞0.05）。以是否患ISH为应变量，性别、年龄、同型半胱氨酸水平、糖尿病患病与否为自变量进行Logistic回归分析，得出同型半胱氨酸及糖尿病为其发病的危险因素。

表1 ISH组与对照组患者的一般资料及相关生化指标比较Tab 1 Comparison of general data and some biochemical indicators between hypertension group and control group

2.2 Hcy 3个关键酶基因型的确定

2.2.1 MTHFR基因酶切后可产生3种基因型:无突变野生C/C型产生195 bp片段，突变杂合子C/T型产生175 bp、130 bp、20 bp片段，突变纯合子T/T型产生130 bp片段。MTRR基因酶切后产生:无突变野生AA型 (126 bp、31 bp），突变杂合子AG型（126bp、157bp、31bp）片段，突变纯合子GG（157bp）。MS基因酶切后产生:无突变野生A/A型（239 bp)，突变杂合子A/G型(239 bp、159 bp、80 bp)，突变纯合子G/G型(130bp)。由于28bp、31bp的条带分子量小，泳动速率快，琼脂糖凝胶电泳未显示（图1～3）。

图1 MTHFR C677T PCR产物酶切图Fig 1 The enzyme digested map for MTHFR C677T PCR products

图2 MTRR基因A66G PCR产物酶切图Fig 2 The enzyme digested map for MTRR A66G PCR products

图3 MS基因A2756G PCR产物酶切图Fig 3 The enzyme digested map about MS A2756G products

2.2.2 本试验中，ISH组及对照组 MTHFR基因C677T、MTR基因A66G、MS基因A2756G的各种基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验（P＜0.05）,表明ISH组及对照组属于遗传平衡体，有群体代表性。从表2中可看出MTHFR基因C677T ISH组的C/T、T/T基因型频率均大于对照组，统计结果亦显示ISH的基因型频率分布与对照组存在差异（χ2=14.487，P=0.001＜0.05），且T等位基因频率ISH组＞对照组（χ2=8.675，P=0.003＜0.05）。表3中MTRR基因A66G ISH组的A/G、G/G及G等位基因频率均低于对照组，但由于样本量小，统计学差异无明显意义（P＞0.05），表4中MS基因型中几乎未见G/G突变纯合子，对照组与ISH组中的基因型频率及等位基因频率无明显差异性（χ2=0.002，P=0.960＞0.05）。

表2 两组MTHFR C677T基因型频率及等位基因频率分布Tab 2 The distribution of MTHFR C677T genetype frequency and allele frequency in the two groups

表3 两组MTRR基因A66G基因型频率及等位基因频率分布Tab 3 The distribution of MTRR A66G genetype frequency and allele frequency in the two groups

表4 两组MS基因A2756G基因型频率及等位基因频率分布Tab 4 The distribution of MS A2756G genetype frequency and allele frequency in the two groups

3 讨论

高同型半胱氨酸血症（HHcy）目前已被大量研究证实是心脑血管病发病的危险因素之一[2]，2006年美国高血压协会发布合并高同型半胱氨酸水平的原发性高血压称之为H型高血压，《中国高血压防治指南2010》中将血浆同型半胱氨酸≥10 μmol/L列入影响高血压患者心脑血管预后的重要危险因素[3]。ISH作为高血压的一个重要亚型，主要是由于血管壁顺应性的下降、僵硬度的升高以及血管内皮功能的紊乱造成的[4-5]，而HHcy也是通过影响体内氧化应激反应、促进血管中层平滑肌细胞增殖和分化、减少NO的生成等机制使血管的顺应性和扩张功能下降及血管外周阻力的上升，从而造成血压升高[6-7]，本试验结果亦表明ISH组的同型半胱氨酸水平高于对照组，且HHcy、糖尿病是ISH发病的危险因素。进一步论证了高同型半胱氨酸血症在ISH发病中的重要作用。

血中Hcy水平主要受环境和遗传等因素的影响[8]，MTHFR编码Hcy代谢通路中的关键酶N5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，它是Hcy再甲基化转化为蛋氨酸的关键酶，该基因的C677T单核苷酸多态性位点的C→T等位基因的突变引起其编码的缬氨酸代替了丙氨酸产生MTHFR酶的不耐热性变化，从而降低了该酶的活性，使催化5，10-亚甲基四氢叶酸反应并提供甲基给Hcy进行转甲基代谢的能力下降，导致Hcy代谢障碍、血浆Hcy水平增高[9]。国内相关研究表明，MTHFR基因多态性与ISH发病关系密切，可能是ISH的易感基因[10]。国外研究亦表明Hcy在MTHFR C677T的不同基因型之间有显著差异[11]，MTHFR C677T不仅是中国男性原发高血压病的危险因素，也与其肾小球滤过率的降低关系密切[12]。本研究结果显示:ISH组患者MTHFR T/T及C/T基因型频率和T等位基因频率均高于对照组（P＜0.05），表明MTHFR基因可能介导了ISH与Hcy水平之间的关系，MTHFR基因C677T位点C到T的突变导致了Hcy水平的升高，从而使ISH的发病率增加。

MTRR基因A66G及MS基因A2756G亦是Hcy的关键酶基因，近年来研究表明MTRR基因A66G多态性与心脑血管疾病及一些出生缺陷发病相关[13-14]，MS是一种维生素B12依赖酶，催化Hcy复甲基化变成甲硫氨酸，目前已发现的8种突变中以D919突变多见，即2756A→G导致天冬氨酸取代了甘氨酸残基，它将引起相应的酶缺乏或活性发生改变，从而导致Hcy代谢异常。MTRR基因定位于5p15.2-15.3，包含15个外显子和14个内含子。其编码的MTRR主要功能是维持钴胺素的活性，而钴胺素是MS的辅酶，参与MS活性的恢复[15]，本研究未发现以上两种基因的多态性与ISH的发病有明显关系，虽ISH组患者MTRR基因A/G及G/G基因型频率和G等位基因频率低于对照组,但无统计学意义，不能推断出G等位基因对ISH的发病有保护作用。而MS基因中突变的G等位基因在所有患者中只有6%左右，两组数据在本研究中无统计学差异，未发现MS基因与ISH的发病有联系。

本研究初步结果提示MTHFR C677T基因C-T的突变似乎与ISH的发病有一定的关系，可能通过影响Hcy的水平，进而促使ISH发病，而MTRR及MS基因与ISH的关系尚需大样本进一步研究。

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（2015-10-19收稿）

Preliminary study on the relationship between the gene polymorphisms of homocysteine metabolismrelated enzymes and isolated systolic hypertension

MA Shi-li1,WANG Wei2,LIANG Rong3
（1.Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.The Fifth Department of Cardiology,TEDA International Cardiovascular Hospital,Tianjin 300457,China;3.General Ward,Chest Hospital of Tianjin,Tianjin 300222,China）

Objective：To study the relationship between the isolated systolic hypertension（ISH）and the gene polymorphisms of homocysteine（Hcy）metabolism-related enzymes.Methods：Two hundred and twenty patients with isolated systolic hypertension were collected as the experimental group and 130 patients without high blood pressure were recruited as the control group.The levels of homocysteine in their blood were detected and the gene polymorphisms of MTHFR C677T（methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T），MTRR A66G（methionine synthase reductase gene A66G）,MS A2756G（methionine synthase gene A2756G）were tested by using the methods of molecular biology.Results:（1）The levels of Hcy in experimental group were higher than those in controls（P＜0.05）.（2）The T/T,T/C genotype frequency and allele T frequency of MTHFR in experimental group were significantly higher than that in controls（P＜0.05）.（3）There were no significant differences in the genotype frequency of MS among the experimental group and control group．（4）The A/G,G/G genotype frequency and allele G frequency of MTRR in experimental group were lower than that in the control group,but with no statistical significance(P＞0.05).Conclusion：The mutation of C677T in MTHFR gene may be associated with the incidence of ISH while the MTRR A66G gene and the MS A2756G gene polymorphism may be not the correlated genes for ISH.

homocysteine；isolated systolic hypertension；methionine synthase reductase；methionine synthase；methylenetetrahydrofolate reductase

R544.1

A

1006－8147（2016）02-0093-04

天津市卫生局科技基金资助项目（2013KZ081）

麻仕利（1989-），女，硕士在读，研究方向：心血管疾病；通信作者：王伟，E-mail：greatwhlm@yahoo.com。