长链非编码RNA HOTAIR在膀胱癌中的表达及临床意义

李宁，马骏

（天津医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，天津300070）

论著

长链非编码RNA HOTAIR在膀胱癌中的表达及临床意义

李宁，马骏

（天津医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，天津300070）

目的：探讨长链非编码RNA HOTAIR在膀胱癌组织与癌旁正常组织的表达差异，了解HOTAIR与膀胱癌恶性程度、进展及预后的相关性。方法：采用qRT-PCR方法检测88例膀胱癌组织与癌旁正常组织中HOTAIR RNA的差异表达，分析HOTAIR表达水平与患者临床病理特征的关系，采用Kapaln-Meier生存分析及COX比例风险回归模型分析HOTAIR表达水平与膀胱患者预后的相关性。结果：膀胱癌组织中HOTAIR RNA表达明显高于癌旁正常组织，HOTAIR RNA高表达与肿瘤高分级及临床高分期有关（P＜0.05），HOTAIR高表达组膀胱癌患者5年生存率明显低于HOTAIR低表达组（P＜0.05），COX回归分析提示HOTAIR RNA高表达可能为膀胱癌不良预后的独立危险因子之一。结论：长链非编码RNA HOTAIR与膀胱癌发生发展及其恶性程度相关，HOTAIR可以作为预测膀胱癌患者生存率的分子标志物。

长链非编码RNA;HOTAIR;膀胱癌

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，据美国国家癌症研究所统计，2014年美国有74 690例新发膀胱癌病例，其中男性56 390例，女性18 300例，并有15 580例患者死于膀胱癌[1]。我国膀胱癌发病率低于欧美国家，但近10年来其发病率逐年增加[2]。75%的新发膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌，非肌层浸润性膀胱癌具有较高的复发率，并有一部分发展为肌层浸润性膀胱癌[3-4]，这使得膀胱癌成为治疗花费最多的恶性肿瘤之一[5]。肌层浸润性膀胱癌患者的预后较差，约有50%的肌层浸润性膀胱癌患者在诊断后3年发生转移和死亡[6]。目前膀胱癌的治疗选择和预后判断主要依赖临床分期和病理分级，然而具有同样临床和病理特点的病人，预后却存在着极大的不同，因此迫切需要寻找到有助于膀胱癌早期诊断和预后判断的新的生物指标[7]。近年来研究发现长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在正常细胞与肿瘤细胞的基因表达调控中起着重要作用，并且lncRNA的异常表达与肿瘤发生、进展密切相关；lncRNA可以作为肿瘤预后的判断指标及新的治疗靶点[8]。HOTAIR是第一个被发现的具备反式调节转录作用的lncRNA，近年来的研究证明HOTAIR在多种恶性肿瘤中高表达，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，其表达量与肿瘤的转移、进展及预后有着重要联系[9]。而目前膀胱癌中HOTAIR的研究相对较少，我们拟通过检测膀胱癌组织HOTAIR的表达情况，分析其与膀胱癌临床病理参数的相关性，明确其对膀胱癌预后的指示作用。

1 材料与方法

1.1 组织标本 本研究88例组织标本来源于天津某医院2006-2008年经全膀胱手术切除的膀胱癌组织及癌旁正常组织，其中男性患者77例，女性患者11例，患者术前未行放疗、化疗，所有标本在手术切除离体后立即置入液氮冷冻，后转入-80℃条件下低温保存，取距离肿瘤边缘3cm以上的正常膀胱黏膜作为对照组，所有组织标本均经病理学检查确认。患者均已签署知情同意书，并经伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 PCR引物（北京六合华大基因科技有限公司），TRIZOL试剂（AppliedInvitrogen,Carlsbad, CA，USA），逆转录试剂盒（PrimeScript RT-PCR kit; Takara Bio），FastStart Universal SYBR Green Master（Roche）。

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA提取及逆转录 按照说明书要求，使用TRIZOL提取膀胱癌组织及癌旁正常组织中的总RNA，1 μg总RNA在20 μL体系中应用逆转录试剂盒按照说明进行逆转录反应，将cDNA冻存于-80℃冰箱备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测膀胱癌组织及癌旁组织中HOTAIR RNA的表达 HOTAIR上游引物: 5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物:5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′，产物长度94 bp。GAPDH上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，产物长度226 bp。按实时荧光定量PCR试剂盒说明书，以20 μL反应体系进行扩增，阴性对照用1 μL DEPC处理的超纯水代替cDNA模板。反应条件:95℃10min；95℃15 s；60℃1 min；45个循环反应。实时荧光定量PCR结果用2T-△△C法进行分析，所有实验均重复3次。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据管理和统计分析，癌组织及癌旁组织中HOTAIR的表达量以s表示，组间表达差异分析采用t检验；定性资料采用χ2检验；应用Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank检验分析HOTAIR表达量与膀胱癌患者预后关系；采用COX比例风险回归模型分析膀胱癌患者预后的危险因素，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 膀胱癌组织与癌旁正常组织中HOTAIR RNA的表达情况 RT-PCR结果显示，HOTAIR RNA在88例膀胱癌组织中的表达量明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（4.026±0.290 vs 1.424±0.106，P＜0.05，图1）。

图1 膀胱癌组织及癌旁正常组织中HOTAIR RNA的相对表达量Fig 1 RelativelevelofHOTAIRinbladdercancertissuesandadjacent non-cancer tissues

2.2 膀胱癌组织中HOTAIR RNA表达量与临床病理关系 根据膀胱癌组织中的HOTAIR RNA的平均表达量确定膀胱癌组织中HOTAIR RNA的高低表达情况。采用χ2检验分析HOTAIR RNA表达情况与膀胱癌临床病理指标相关性。高表达的HOTAIR RNA与病理分期（P＜0.001）、分级密切相关（P=0.001），与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小没有相关性（表1）。

表1 癌组织中HOTAIR表达量与临床病理参数的关系Tab 1 Association between HOTAIR expression and various clinicopath ological factors of bladder cancer patients

2.3 HOTAIR RNA表达量对膀胱癌患者生存时间的影响 采用Kaplan-Meier生存曲线分析膀胱癌组织中HOTAIR RNA表达情况对膀胱癌患者5年生存率的影响，HOTAIR RNA高表达组膀胱癌患者5年生存率低于HOTAIR RNA低表达组，差异具有统计学意义（P＜0.001，Log-Rank检验，图2）。进一步通过COX比例风险回归分析模型分析了与膀胱癌患者预后相关的影响因素:单因素分析显示，病理分期，HOTAIR的表达水平为影响膀胱癌患者5年生存率的危险因素；多因素分析显示，膀胱癌组织中HOTAIR的表达水平，可以作为膀胱癌患者5年生存率的独立预测因子（表2）。

图2 膀胱癌不同HOTAIR表达组患者生存率Fig 2 The overall survival rate of patients estimated according to the HOTAIR expression level in bladder cancer patients

表2 COX比例风险模型分析患者生存影响因素Tab 2 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors with respect to 5-year overall survival of patients with bladder cancer

3 讨论

基因表达的异常调控在肿瘤发生发展过程中起到了重要作用。一般情况下，人类常染色体中几乎所有核苷酸都有转录现象[10]。随着基因组测序计划的完成以及新一代深度测序技术的应用，人们发现哺乳动物中多于95%的转录序列为非编码RNA[11]。lncRNA是长度大于200 bp的非编码RNA分子，与micoRNA不同，lncRNA研究尚处于起步阶段。越来越多的研究开始将lncRNA与疾病联系起来，其表达异常能够引起一系列疾病包括肿瘤的发生发展。HOTAIR是lncRNAs的成员之一，转录本长度为2.2 kb，定位在人类染色体12q13.13上的HOXC家族的HOXC11基因和HOX12基因之间[12]。在乳腺癌中研究发现，HOTAIR在乳腺癌原发病灶及转移性病灶中高表达，与乳腺癌的进展转移存在重要关系，为预测乳腺癌患者生存率的独立危险因素[9]。在肝癌、胃肠道间质瘤以及胰腺癌中亦发现了HOTAIR的表达明显升高，HOTAIR表达水平与患者生存期呈负相关[13-15]。

本研究通过qRT-PCR检测HOTAIR在膀胱癌组织及癌旁正常组织中的差异表达，实验结果证实，膀胱癌组织中HOTAIR的表达量明显高于癌旁正常组织；结合临床病理相关数据进行统计分析，发现膀胱癌组织中HOTAIR的表达量与膀胱癌高分期、分级密切相关，而与患者年龄，性别，吸烟史，肿瘤大小没有相关性。据此我们推测HOTAIR可能与膀胱癌的发生进展存在相关性。为了证实这一推测，笔者采用Kaplan-Merier生存分析方法检验了不同HOTAIR表达组膀胱癌患者5年生存率的差异，HOTAIR高表达组膀胱癌患者5年生存率明显低于HOTAIR低表达组，差异具有明显的统计学意义。进一步的COX回归分析证实，高表达的HOTAIR为膀胱癌不良预后的独立危险因子之一。本研究也检测了Ta/T1期膀胱癌患者中HOTAIR的表达情况，发现HOTAIR高表达为膀胱癌复发的预测因素之一[16]。笔者纳入的研究标本皆取自全膀胱切除患者组织标本，其中Ta/T1期患者34例，T2-T4期患者54例，通过分析不同HOTAIR表达组患者5年生存率的差异，进一步证实了HOTAIR对膀胱癌预后的提示作用。据此推测HOTAIR与膀胱癌的发生进展密切相关，但其调控膀胱癌发生进展的具体机制尚不明确，我们将进一步通过体外体内试验，分析HOTAIR调控膀胱癌进展的具体机制。

膀胱癌临床病理分期分级对膀胱癌的治疗选择及预后判断具有重要的提示作用，然而它们对于膀胱癌患者预后的提示、治疗方式的选择同时存在一定的局限性，尤其是对于行膀胱癌电切的患者，存在病理分期分级偏低的可能，而且具有同样病理分期分级的患者，预后也大不相同[17]。笔者将进一步扩大研究的样本量，在更多的样本中去验证HOTAIR表达量对膀胱癌患者预后的提示作用，为膀胱癌的个体化治疗提供参考。

综上所述，我们的研究证实HOTAIR在膀胱癌组织中高表达，高表达的HOTAIR与膀胱癌病理分期、分级密切相关，可以作为膀胱癌恶性程度判断的辅助指标，高表达的HOTAIR可以作为膀胱癌预后监测重要分子标志物。

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（2015－09－16修稿）

Clinical significance of HOTAIR expression in patients with bladder cancer

LI Ning,MA Jun
（Department of Epidemiology and Health Statistics,School of Public Health,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective：To investigate the HOTAIR expression in bladder cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues and its potential relevance to clinicopathological variables and prognosis.Methods：HOTAIR RNA expression was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction in 88 pairs of bladder cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues.Kapaln-Meier analysis and COX proportional hazards regression models were used to investigate the correlation between HOTAIR expression and prognosis of bladder cancer patients.Results：This study showed that the expression level of HOTAIR in bladder cancer tissues was significantly higher than those in non-cancerous tissues.The results indicated that high expression of HOTAIR in bladder cancer was associated with advanced stage and high grade（P＜0.05）.Kapaln-Meier survival analysis suggested that patients with high HOTAIR expression was associated with poor overall survival（P＜0.05）.Multivariate analysis revealed that HOTAIR expression was an independent predictor of overall survival. Conclusions：HOTAIR might play a positive role in bladder cancer development and could serve as an biomarker for overall survival of bladder cancer.

long non-coding RNA;HOTAIR;bladder cancer

R737.14

A

1006-8147（2016）02-0126-03

李宁（1984-），女，硕士在读，研究方向：流行病与卫生统计学；通信作者：马骏，E-mail：majun@tmu.edu.cn。